ICS65.020.30 B41 D B 32 备案号： 江 苏省地方标准 DB32/T1769—2011 马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法 MethodofPCRfordetectingStreptococcuszooepidemicus 2011-05-06发布 2011-07-06实施 发布 江苏省质量技术监督局  DB32/T1769—2011 前 言 为规范马链球菌兽疫亚种分子生物学检测技术，提高马链球菌兽疫亚种检测的灵敏度、稳定性、特 异性，特制定本标准。 本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编写。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由江苏省农业科学院提出。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准起草人：倪艳秀、何孔旺、吕立新、张雪寒、周俊明、俞正玉、茅爱华、温立斌、郭容利、 李成仁、李彬、王小敏。 I  DB32/T1769—2011 马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法 1范围 本标准规定了马链球菌兽疫亚种的检测PCR方法所用的仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、 结果判定、废弃物处理和防止污染的措施等技术标准。 本标准适用于马链球菌兽疫亚种的PCR检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引物文件，仅注日期的版本适用于本文件， 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法 3原理 PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子 链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。本标准根据 GenBank上公布的马链球菌兽疫亚种类M蛋白基因序列，在其保守区设计一对特异性引物，经过了PCR 条件的优化、特异性实验、敏感性实验等，对马链球菌兽疫亚种的鉴定具有很高的准确性。 4仪器设备和主要试剂 4.1仪器设备 4.1.1高速离心机 4.1.2水浴锅 4.1.3PCR仪 4.1.4核酸电泳仪 4.1.5凝胶成像系统 4.2主要试剂 除另有规定，所用试剂均为分析纯。 4.2.1生理盐水 4.2.2蛋白酶K 4.2.3 Taq酶 4.2.4dNTP 4.2.5琼脂糖，电泳级 5引物 1  DB32/T1769—2011 上游引物：5′-GCAGCCCTCTTGGTTGGT-3′；下游引物：5′-CTGCGTCAGCGTCTCCAT-3′。 6方法步骤 试验用水：按照GB/T6682-2008三级水标准。 6.1样品处理 6.1.1病料样品处理 采用差速离心法：取约5g病料，剪碎研磨，用5mL生理盐水混悬，先2000r/min离心2min， 去除大组织块，取上清液，后10000r/min离心5min，弃上清液，沉淀以灭菌水重悬，备用。 6.1.2可疑培养物样品处理 取可疑培养物1mL10000r/min离心5min，弃上清，沉淀以200μL灭菌水重悬，备用。 阴性对照：液体培养基。 阳性对照：马链球菌兽疫亚种液体培养物。 阴性、阳性对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。 6.2DNA提取 取ddH2O溶解的样品，每200μL加入3μL蛋白酶K（20mg/mL），42℃作用1h，煮沸5min，10000 r／min离心5min，上清作为模板。 6.3PCR扩增 6.3.1反应条件 按25μL体系进行，10×buffer2.5μL，MgCl2（25mM）1.5μL，dNTP（2.5mM）1.0μL，上游引 物（50pmol/μL）0.5μL，下游引物（50pmol/μL）0.5μL，模板DNA3.0μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL， 灭菌水15.5μL。按如下条件进行PCR反应。95℃5min，然后进入循环94℃1min，60.2℃1min， 72℃1min，35个循环，于72℃延伸10min，4℃保存。 6.3.2电泳 将PCR反应产物于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120V，时间30min。 6.3.3结果观察 用凝胶成像系统观察结果，并进行拍照。 7结果判定 7.1试验结果成立条件 阳性对照的PCR产物电泳后在364bp的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条 带，试验结果成立；否则，结果不成立。 7.2结果判定 7.2.1在试验结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在364bp的位置上出现一条特异性条 2  DB32/T1769—2011 带，判为阳性，即该样品为马链球菌兽疫亚种核酸阳性。 7.2.2在试验结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在364bp的位置上未出现一条特异性 条带，判为阴性，即该样品为马链球菌兽疫亚种核酸阴性。 7.2.3如果阳性对照无相应的目的条带，可能是存在操作失误，该试验需要做重复试验；如果阴性对 照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该试验需要做重复试验。 8废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录A。 3