ICS65.150B50DB32备案号：51404-2016江苏省地方标准DB32/T 2957-2016鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法PCR inspection specification of cyprinid herpesvirusⅡ2016-09-20发布2016-11-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T 2957-2016前言本标准按GB/T1.1–2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》要求进行编写。本标准由江苏省海洋与渔业局提出。本标准起草单位：江苏省水生动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：陈辉、袁锐、方苹、倪金俤、刘训猛、陈静、郭立新、吴亚锋IDB32/T 2957-2016鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法1范围本标准规定了鲤疱疹病毒Ⅱ型（cyprinidherpesvirusⅡ）检测方法的试剂和材料、仪器和设备、采样、检测步骤和结果判断。本标准适用于鲫鱼疱疹病毒病病原的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法SC/T 7014-2008水生动物产地检疫采样技术规范3试剂和材料水3.1符合 GB/T 6682-2008中一级水的规格。(该水用来配置规范性附录A中所列试剂)无水乙醇3.23.33.4十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）Taq DNA聚合酶及配套的10×PCR缓冲液Taq DNA聚合酶或Ex Taq DNA聚合酶，生化试剂，-20℃保存。10×PCR缓冲液为该酶配套的相应反应缓冲液，生化试剂，-20℃保存。3.53.6MgCl 2（25mmol/L）：生化试剂，-20℃保存。dNTPs混合物含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/L的混合物，-20℃保存。5×TBE电泳缓冲液（按附录A的规定）。3.73.83.96×DNA上样缓冲液（按附录A的规定）。引物及扩增片段鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因扩增引物：P1：5’-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3’，P2：5’-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3’。扩增片段大小为 362 bp。注：该引物为扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因的通用引物。3.10DNA分子量标准1DB32/T 2957-2016宜使用 DNA marker 2000，各片段大小依次为：2000 bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，也可使用其他合适的 DNA分子量标准。3.11阳性对照阳性对照为已知受鲤疱疹病毒Ⅱ型感染，且 PCR检测结果为鲤疱疹病毒Ⅱ型阳性并经测序验证的DNA模板，-20℃保存。3.12阴性对照好阴性对照为已知未受鲤疱疹病毒Ⅱ型感染，且 PCR检测结果为鲤疱疹病毒Ⅱ型阴性的组织，提取DNA，-20℃保存。3.13空白对照灭菌双蒸水（无 DNA酶）。核酸染色剂3.14GoldviewTM核酸染料或其他宜使用的核酸染料。4仪器和设备4.14.24.34.44.54.64.7台式高速离心机：最高转速可达 12000 rpm以上。普通冰箱：具有冷藏箱，-20℃以下冷冻箱体。PCR仪。电泳仪：输出直流电压 0-600V。水平电泳槽。凝胶成像仪。水浴锅或者金属浴。5采样5.1采样数量按 SC/T 7014-2008中6.1的规定执行。5.25.3个体要求活鱼或濒死的鱼。采样部位有临床症状的鱼，如体长不超过 4 cm，取鳃；体长为 4 cm~6 cm，取鳃和内脏（包括肾）；体长大于 6cm，则取脑、肝、肾、脾和鳃组织。无症状的鱼取肾、脾、鳃和脑组织。性成熟雌鱼还需取卵巢液。2DB32/T 2957-20165.4操作要求5.4.1采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。5.4.2镊子，剪刀等取样工具需要进行灭菌（湿热灭菌为 121℃，20 min；干燥灭菌为 160℃，3小时）。5.4.3实验室以外的环境下采得的组织样品需用液氮及时保存。6检测步骤6.1DNA抽提6.1.1取 100 mg左右待检新鲜组织与 300 μL CTAB溶液研磨匀浆，置于1.5 mL离心管内。加入