ICS 65.020.9 99 B61 DB6111 杨凌农业高新技术产业示范区地方标准 DB 61 111/T13 33—2019 谷子杂种快速鉴定技术规范 Technical Specification for Rapid Identification of Foxtail Millet Hybrids 2019-08-15发布 2019-09-01实施 杨凌示范区市场监督管理局发布 DB61 111/T13 33—2019 前言 本规范依据GB/T1.1-20 009给出的规定起草。 本规范由杨凌示范区农业标准化技术委员会提出并归口。 本规范起草单位：西北农林科技大学。 本规范主要起草人：冯佰利、袁雨豪、杨璞、高小丽、王鹏科、高金锋、宋慧、梁鸡保。 有关专利的说明按照GB/T1.1-20 009中附录C进行。 本规范首次发布。 DB61 111/T13 33—2019 谷子杂种快速鉴定技术规范 1 范围 本规范规定了谷子杂种快速鉴定的术语和定义、鉴定步骤及鉴定结果汇总。 本规范适用于谷子F1代杂合单株的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T8232粟（谷子） GB/T3098 88多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 亲本 Parentslines 杂交育种中所选用的雌雄性个体。 3.2 杂种F1HybridF1 采用温汤杀雄、阳光杀雄或人工去雄等方法去雄后授粉，获得的F1种子。 3.3 S SSR标记 SimpleSequenceRepeatsmarker 一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，是一类由几个核苷酸（一般为1～6个）为重复单位组 成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。 4 鉴定步骤 4.1基因组DNA提取 选取符合GB/T8282的谷子杂交种，参照GB/T3098 88提取基因组DNA，用超微量分光光度仪测定DNA 含量，用ddH2O稀释到所需工作浓度（30ng/ìL）。试验所用试剂见附录A。 4.2 PCR扩增反应体系和程序 DB61 111/T13 33—2019 4.2.1扩增体系 反应总体积10ìL，其中模板DNA样品（30ng/ìL）2ìL，10×PCRbuf ffer（Mg2+）1ìL，dNTPs（2.5 m mmol/L）1ìL，PrimerF（10ìmol/L）0.5ìL，PrimerR（10ìmol/L）0.5ìL，TaqE（5U/ìL）0.1ìL。 试验所用试剂见附录A。 4.2.2反应程序 将反应体系混匀后进行PCR扩增：95℃预变性3min，95℃变性30s，50℃～65℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸10min，16℃保存。将扩增后的PCR产物加入2ìL非变性6×Loading buf ffer，混合均匀，短时间内置于4℃保存，长时间内置于-20℃保存备用。扩增产物用8%聚丙烯酰 胺检测。 4.3聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 4.3.1制胶 洗涤：将A、B板洗涤至清水无阻力流下，竖立晾干。 封底：每板15ml8%聚丙烯酰胺，加入150ìL10%过硫酸铵和15ìL四甲基乙二胺，聚合1min。 分离胶：每板25ml8%聚丙烯酰胺，加入10 00ìL10%过硫酸铵和50ìL四甲基乙二胺，聚合1h。 4.3.2电泳 待凝胶1h后，将与6×Loadingbuf ffer混合后的PCR扩增产物每个点样孔加入3ìL。电泳缓冲液为 1×TBE，150V～180V恒压条件下电泳1.5h～2h。 4.3.3银染 固定：将完成电泳的胶块放入固定液中，振摇12min以上。 银染：固定完成后，倒出固定液，加入银染液，振摇12min。 脱色：银染完成后，倒出银染液，加入ddH2O，振摇1min。 显影：脱色完成后，倒出ddH2O，加入30 00mL现配的显影液，待谱带清晰（以Marker为准）后照相 并记录带型。 4.3.4亲本间多态性 S SSR标记筛选 用附录B中的SSR引物进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。。。。。。以下内容略