ICS 65.020.20 B 61 LY 中华人民共和国林业行业标准 LY/T 3107—2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 Technical regulation for willow varieties identification by SSR markers （发布稿） 2019 - 10 - 23发布 2020 - 04 - 01实施 国家林业和草原局 发布 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由全国林木种子标准化技术委员会（SAC/TC 115）提出并归口。 本标准主要起草单位：南京林业大学。 本标准参加起草单位：江苏省 林业科学研究院；山东省林业科学研究院。 本标准主要起草人：李淑娴、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东。 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 范围 本标准 规定 了以柳 属 ( Salix ) 植物 DNA 为材料，利用微卫星标记 ( microsatellite ) 对 国 家和省审 ( 认 ) 定 的 柳树品种进行分子鉴定 的规范化 操作 技术 。 本标准适用于附录 A 中所列柳树品种的鉴别。 2 术语和定义 2.1 微卫星 标记 microsatellite 微卫星 标记 ，又被称为短串联重复序列 (short tandem repeats, STRs) 或简单重复序列 ( simple sequence repeats ，简称 SSR ) ， 是指基因组中由 2 ～ 6 个核苷酸组成的 DNA 串联重复序列。 2.2 基因型频率 g enotype frequency 基因型频率指不同基因型在全部个体中所占的比率，全部基因型频率的总和为 1 或 100% 。 3 操作程序 3. 1 取样 和保存 取 柳树幼嫩叶片 5 片 ～ 10 片，用干燥硅胶密封保存，用于 DNA 提取。 3.2 DNA 提取所需试剂 a) 1 M Tris ：称取 1 2.11 g Tris 溶解到 8 0 mL 超纯水中，调节 pH= 8.0 ，定容到 1 00 mL 。 b) 0 .5 M EDTA ：称取 1 8.61 g EDTA 溶解到 8 0 mL 超纯水中，调节 pH= 8.0 ，定容到 1 00 mL 。 c) 5 M 氯化钠：称取 2 3.38 g 氯化钠溶解到 8 0 mL 超纯水中，定容到 1 00 mL 。 d) 5 M 醋酸钾：称取 2 5.54 g 醋酸钾， 2 00 mL 超纯水溶解后定容到 2 50 m L 。 e) 2 % SDS ：称取 1 .0 g 十二烷基硫酸钠 ( SDS) ， 4 0 mL 超纯水溶解后定容到 5 0 mL 。 f) 10 % CTAB ：称取 1 0 g CTAB( 十六烷基三甲基溴化铵 ) 溶解到 8 0 mL 超纯水中，定容 到 1 00 mL 。 g) 氯仿异戊醇： 240 mL 氯仿， 1 0 mL 异戊醇混合。 h) 7 0 % 乙醇： 70 m L 乙醇，加入 3 0 m L 超纯水。 i) CTAB 裂解液 ： 1 mL 1 M Tris (pH=8.0) ， 4 mL 0.5 M EDTA(pH=8.0) ， 2 8 mL 5 M 氯化钠， 1 0 mL 10 % CTAB ， 5 g 聚乙烯吡咯烷酮，定容到 1 00 m