ICS 65.020.40 B 61 DB51 四川省地方标准 DB51/T 2582—2019 应用微卫星 DNA标记扭角羚个体司法鉴定 技术规范 2019 -04 -16发布 2019 -05 -01实施 四川省市场监督管理局发布  DB51/T 2582—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语、定义和缩略语 ................................................................ 1 4 PCR引物的选择 ..................................................................... 1 5 DNA的提取与检测 ................................................................... 1 6 PCR反应与 PCR产物测序 ............................................................. 2 7 基因分型 .......................................................................... 2 8 个体识别 .......................................................................... 3 附录A（规范性附录） 扭角羚微卫星标记信息 ............................................. 4 I  DB51/T 2582—2019 前 言 本标准按GB/T1.1－2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》的规定编写。 本标准由四川省林业和草原局提出并归口。 本标准由四川省市场监督管理局批准。 本标准主要起草单位：四川省林业科学研究院。 本标准主要起草人：靳伟 毛毳 刘滢询 费然 夏云。 II  DB51/T 2582—2019 应用微卫星 DNA标记扭角羚个体司法鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了利用DNA 简单重复序列微卫星分子标记对扭角羚进行司法鉴定的原理、试剂、仪器、 分析步骤和结果判定标准。 本标准适用于四川省扭角羚个体司法鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GA/T 383-2002 法庭科学DNA实验室检验规范 SN/T 1193-2003 基因检验实验室技术要求 NY/T 1673-2008 畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程 1 3 术语、定义和缩略语 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA样品 DNA sample 是指利用扭角羚组织（如毛发、血液、精液、肌肉组织等）或新鲜粪便提取的扭角羚基因组DNA。 3.2 微卫星特异性引物 Microsate llite specific primers 用于扭角羚微卫星DNA分子鉴定选用的一套微卫星引物。具有多态性、稳定性、重复性等综合特点。 统一推荐使用9个微卫星标记（附录A），其中1-7号为基本标记，8-9号为备选标记，可根据工作目标选 用合适数量的微卫星标记。只有当基本标记不够用时，才使用备选标记。 4 PCR引物的选择 推荐使用的9个微卫星标记的PCR引物序列设计参见附录A。 5 DNA的提取与检测  DB51/T 2582—2019 5.1 DNA样品准备 通过现场或实验室取样，将DNA样品用蒸馏水洗净后放入盛有95％酒精的离心管中，4℃保存待用。 5.2 基因组 DNA的提取 采用酚／氯仿抽提方法提取总DNA，具体操作参照《分子克隆实验指南（第3版）》。 其他DNA提取方法若DNA质量能够符合PCR扩增需要的都可用于本标准。 5.3 DNA浓度检测 5.3.1 紫外吸收定性测试 应保证A260／A280比值在 1.8–2.0范围内，方可正常进行后续实验。 5.3.2 紫外吸收定量测试 应保证DNA浓度在10 μg/mL以上，方可正常进行后续实验。 6 PCR反应与 PCR产物测序 6.1 PCR扩增的反应体系和扩增程序 10×PCR buffer 2.0 μL 2 MgCl2 (25mmol/L) 2.0 μL dNTP (2.5mM) 1.0 μL Taq polymerase (2.5U/μL) 0.2μL 引物-F（ 15 pmol/ μL） 0.5μL 引物-R（ 15pmol/ μL） 0.5μL 模板DNA 2.0μL ddH2O 11.0 μL BSA (1mg/mL) 0.8 μL 合计 20 μL PCR扩增程序：95℃预变性5分钟，然后35个循环包括94℃变性 50 s, 55℃-65℃（根据不同的引物 确定）退火45s, 72 ℃延伸 30s，最后72 ℃延伸10分钟，4℃保存。 6.2 PCR产物的质量检测 当PCR扩增完成后，取PCR产物5μL，经1.5%-2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳条带清楚、片段大小 正确，表明PCR扩增成功； 将符合质量要求的PCR产物避光（使用锡箔纸盒）存放于4℃冰箱，用于基因分型； 7 基因分型 将符合质量要求的PCR产物送有关公司进行基因扫描分型。 为了获得更加可信的基因型，最好宜采用多管PCR（multi-tube approach）扩增方案。