江苏省市场监督管理局 发布 2019-12-25实施 2019-12-03发布 猪链球菌9型PCR检测技术规程 Technical regulation for PCR detecting Streptococcus suis Serotype 9 DB32/T 3683—2019 DB32 江苏省地方标准 ICS 11.220 B 41 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：倪艳秀、何孔旺、周俊明、祝昊丹、吕立新、俞正玉、王丹丹、张雪寒、温立 斌、李彬。 猪链球菌9型PCR检测技术规程 1 范围 本标准规定了猪链球菌9型PCR检测技术所用的仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、结果判定、 废弃物处理和防止污染的措施等要求。 本标准适用于猪链球菌9型的PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件 的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 《病死及病害动物无害化处理技术规范》（农医发〔2017〕25号） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猪链球菌 9 型 Streptococcus suis serotype 9 属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分 为 1 - 31 、 33 及 1/2 共 33 个血清型。猪 链球菌 9 型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种人兽共 患病病原菌。 4 仪器设备和主要试剂 4.1 仪器设备 高速离心机、水浴锅、 PCR 仪、 核酸电泳仪、凝胶成像系统。 4.2 主要试剂 生理盐水、 超纯水、 蛋白酶K、 2×PCR Mix、琼脂糖（电泳级）、DNA分子量标准（DL 2000 Marker）。 5 引物 5.1 上游引物：5′- GGCTACATATAATGGAAGCCC- 3′。 5.2 下游引物：5′- CCGAAGTATCTGGGCTACTG- 3′。 6 方法步骤 6.1 样品处理 6.1.1 病料样品处理 采用差速离心法，取约5 g病料（肝或肺或脑组织），剪碎研磨，用5 mL生理盐水混悬，先2 000 r/min离心2 min，去除大组织块，取上清液，后10 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀以200 μL超 纯水重悬，备用。 6.1.2 待检培养物样品处理 取待检液体培养物（纯培养物或混合培养物）1 mL 10 000 r/min 离心5 min，弃上清，沉淀以200 μL 超纯水重悬，备用。阴性对照：THB培养基。阳性对照：猪链球菌9型标准菌株（22083）的THB培 养物。阴性、阳性对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。 6.2 DNA提取 取6.1获得的样品及对照，每200 μL加入3 μL蛋白酶K（20 mg/mL），42 ℃作用1 h，煮沸5 min， 10 000 r／min离心5 min，上清作为模板DNA。 6.3 PCR扩增 6.3.1 反应条件 按25 μL体系进行，2× PCR Mix 12.5 μL，上游引物（10 pmol/μL）1.0 μL，下游引物（10 pmol/μL） 1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，超纯水 8.5 μL。按如下条件进行PCR反应。95 ℃ 5 min，然后进入循环94 ℃ 30 sec，55 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，35个循环，于72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。 6.3.2 电泳 将PCR反应产物于1.2 %琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120 V，时间30 min。 6.3.3 结果观察 用凝胶成像系统观察结果，并进行拍照。 7 结果判定 7.1 检测结果成立条件 阳性对照的PCR产物电泳后