ICS 11.220 ICS 11.220 DB22 吉 林省地 方标准 DB 22/T 2972—2019 羊泰勒虫病病原检测 PCR法 PCR assay for detection of theileria ovis 2019-05-27发布 2019-06-17实施 吉林省市场监督管理厅 发布 本标准仅供内部使用 本标准仅供内部使用 印 本标准仅供内部使用 不得翻 印 前 言 前 言 DB22/T 2972—2019 本标准仅供内部使用 本标准仅供内部使用 印 本标准仅供内部使用 不得翻 印 DB22/T 2972—2019 羊泰勒虫病病原检测 PCR法 范围 本标准规定了羊泰勒虫病病原PCR检测方法原理、试剂和仪器、样品采集、操作步骤和判定结果。 本标准适用于绵羊泰勒虫病病原检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 双链DNA在高温加热的作用下变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则，通 过人工合成的特异性寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链，再利用反应 试剂 试剂和仪器 混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)合成新生的DNA互补链，进而完成特定片段的体外扩增。 本标准仅供内部使用 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 4.1.1血液 DNA提取试剂盒。 4.1.2 10×PCR 缓冲液。 4.1.3dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），浓度2.5 mmol/L。 4.1.4Taq DNA聚合酶，浓度 5 U/ μL。 4.1.5 50×TAE缓冲液见表 A.1。 4.1.610 mg/mL溴化乙锭见表A.2。 4.1.71%琼脂糖凝胶见表A.3。 4.1.8加样缓冲液见表A.4。 4.1.9阴性对照为健康绵羊血液 DNA提取物。 4.1.10 阳性对照为羊泰勒虫感染的绵羊血液 DNA或含有目的片段 DNA序列，DNA序列参见附录 B。 4.1.11空白对照为灭菌双蒸水。 4.1.12DNA Marker分子量标准。 4.2 耗材 4.2.1抗凝管。 4.2.2 吸头（200 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、2 μL～20 μL、0.5 μL～10 μL）。 1 引物 引物 长度/bp 基因序列 浓度/μmol/LP1（上游引物） 5'-TGATGAGTTGATGTATTGTGGC-3' 671 18S rRNA (AY262119) 10 P2（下游引物） 5'-TACCCGCATCCTATTTAGCAG-3' DB22/T 2972—2019 4.2.3 Eppendorf 管（1.5 mL、0.5 mL、0.2 mL）。 4.2.4 PCR反应管。 三角瓶。 表1 引物序列与浓度 引物序列与浓度见表 1。 引物 本标准仅供内部使 用 4.4 仪器设备 4.4.1微量加样器，单道 2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL和1000 μL。 4.4.2低温高速离心机，12 000 r/min 以上。 4.4.3 PCR扩增仪，温度范围为4 ℃～100 ℃。 4.4.4 分析天平，感量0.1 mg。 高压灭菌器，120 ℃ 以上。 微波炉或恒温水浴锅，室温～100 ℃。 水平电泳槽。 电泳仪，电压1 V～300 V，电流1 mA～400 mA。 凝胶成像系统或紫外灯。 样品采集 用抗凝管（4.2.1）无菌采集待检绵羊血液样品5 mL，编号。冷藏条件下送实验室检测。 操作步骤 6.1 样品 DNA制备 按照血液DNA提取试剂盒（4.1.1）操作说明书，提取待检绵羊血液样品基因组DNA、阴性对照（4.1.9） 样品基因组DNA和阳性对照（4.1.10）样品基因组DNA。 6.2 PCR检测