ICS 11.220 B 41 DB33 浙江省地方标准 DB33/T 2269—2020 猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR 检测方法 Duplex fluorescence quantitative PCR method for the detection of porcine circovirus type 2 and type 3 2020 - 06 - 30发布 2020 - 07 - 30实施 浙江省市场监督管理局 发布 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江农林大学。 本标准主要起草人：宋厚辉、邵春艳、周莹珊、王晓杜、孙静、姜胜、杨永春、程昌勇、章先、杨 杨、卫芳芳。 猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR检测方法 1 范围 本标准规定了猪圆环病毒2型与3型双重荧光定量PCR的检测方法。 本标准适用于猪圆环病毒2型与3型的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：达到阈值的循环数（Cycle threshold） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid） PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Solution） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） PCV-2：猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus 2） PCV-3：猪圆环病毒3型（Porcine Circovirus 3） Taq酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase） 4 试剂和材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯；灭菌水，0.01 mol/L PBS和8 mmol/L NaOH配制中所使用的 水应符合GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法中一级水的要求。 4.1 DNAzol Reagent：DNA抽提试剂，2 ℃～8 ℃保存。 4.2 无水乙醇：4 ℃预冷。 4.3 75%乙醇：用无水乙醇和灭菌水配制，-20 ℃预冷。 4.4 8 mmol/L NaOH溶液：配制方法见附录A。 4.5 0.01 mol/L PBS，pH 7.2：配制方法见附录A。 4.6 2×Premix HS Taq（内含PCR buffer，HS Taq，dNTPs，Mg2+，RNaseH等）。 4.7 阳性对照：猪圆环病毒2型灭活疫苗和猪圆环病毒3型阳性克隆质粒。PCV-3目的基因（ORF2） 序列见附录A。 4.8 空白对照：灭菌水。 4.9 用于荧光定量PCR的引物浓度为10 μmol/L，Taqman探针浓度5 μmol/L，其序列分别为： ——PCV-2-F：5’-TCACCTATGACCCCTATG-3’； ——PCV-2-R：5’-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3’； ——PCV-2-P：5’-FAM-ACTCCTCTCGCCATACCATAACC-BHQ1-3’； ——PCV-3-F：5’-TGGCTCAACACATATGAC-3’； ——PCV-3-R：5’-ACGGACTTGTAACGAATC-3’； ——PCV-3-P：5’-HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-BHQ1-3’。 4.10 一次性耗材：乳胶手套、1.5 mL离心管、15 mL离心管、荧光PCR反应管和吸头。 5 器材和设备 5.1 电热干燥箱。 5.2 高压灭菌锅。 5.3 高速台式冷冻离心机：可控温至4 ℃，最大离心速度可达12 000 r/min以上。 5.4 冷藏冰箱，超低温冰箱（-80