ICS 65.020.30 B 43 DB33 浙江省地方标准 DB33/T 2247—2020 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量 RT-PCR检测方法 Method of RT-PCR and the real-time RT-PCR for the detection of duck tembusu virus disease 2020 - 03 - 03发布 2020 - 04 - 03实施 浙江省市场监督管理局 发布 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心、浙江省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：云涛、徐辉、周彩琴、张存、赵灵燕、余斌、吴赟竑、张传亮、吴雪军、黄晓 兵、冯肖肖、华炯钢、吕见涛、张娟敏、鲍伟华。 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法 1 范围 本标准规定了鸭坦布苏病毒的反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光定量RT-PCR的实验条 件、操作步骤和结果判定等要求。 本标准适用于鸭坦布苏病毒核酸的检测。 2 术语和定义 2.1 鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus，DTMUV） 属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类、Ntaya病毒群，可引起鸭、鹅产蛋下降，雏鸭、雏鹅发病 死亡。 3 实验条件 3.1 主要仪器设备 3.1.1 PCR仪。 3.1.2 荧光定量PCR仪。 3.1.3 微量移液器。 3.1.4 组织匀浆器。 3.1.5 电泳仪。 3.1.6 电泳槽。 3.1.7 水浴锅。 3.1.8 紫外凝胶成像系统。 3.1.9 高速台式低温离心机。 3.1.10 生物安全柜。 3.2 试剂 3.2.1 0.01M 磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L， pH7.4 PBS）：称取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.9 g Na2HPO4.12H2O、 0.2 g KH2PO4，将上述试剂溶于800 mL去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH调节至7.4，然 后加去离子水定容至1 L，高温灭菌30 min，室温保存。 3.2.2 氯仿。 3.2.3 异丙醇。 3.2.4 焦炭酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌去离子水：用DEPC 50 μL，加超纯水至100 mL，室温过夜，121℃高压灭菌15 min，分装到1.5 mL DEPC处理过的离心管，冻存备用。 3.2.5 75%乙醇：取新开启的无水乙醇75 mL，加DEPC水至100 mL，混匀，-20℃预冷。 3.2.6 溴化乙锭 （EB）：取1.0 g溴化乙锭，加去离子水，定容至100 mL。充分溶解后的溴乙锭溶 液转移至棕色瓶中，室温避光保存，其工作浓度为0.5 μg /mL。 3.2.7 1×TAE缓冲液：取242 g羟基甲基氨基甲烷（Tris）、37.2 g二水乙二铵四乙酸二钠、57.1 mL 冰乙酸，加去离子水定容至1 L，配置成50×TAE电泳缓冲液；量取20 mL的 50×TAE电泳缓冲液，加 入去离子水定容至1 L，室温保存。 3.2.8 1%琼脂糖凝胶：称取1.0 g琼脂糖，加入1×TAE电泳缓冲液100 mL，轻轻混匀后加热，使琼脂 糖完全熔化。待琼脂糖胶冷至50℃～60℃时，加EB溶液（终浓度0.5 μg/mL）或5 μL核酸染料，摇 匀后倒入制胶板中，厚度为3 mm～5 mm，室温凝固后取下电泳梳子，备用。 3.2.9 DNA相对分子质量标准物 Marker：DL 2000。 3.2.10 10×加样缓冲液：称取25 g聚蔗糖、0.1 g溴酚蓝、0.1 g二甲苯青，加入灭菌双蒸水定容至 100 mL。 3.2.11 商品化的一步法实时荧光RT-PCR反应试剂盒。One Step Prime Script. RT-PCR Kit（Perfect Real Time，TAKARA)，含有RT-PCR缓冲液，酶混合物，dNTP混合物，无RNA酶的水等。 3.2.12 M-MLV反转录酶。 3.