ICS 67.050B 45DB12天 津 市 地 方 标 准DB12/T 653—2016鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测实时荧光 PCR法Quantitative PCR method for animal derived materials in meat and meat products2016-09-27发布2016-11-01实施天津市市场和质量监督管理委员会发布DB12/T 653—2016前言本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：赵新、易萌、刘娜、兰青阔、刘雪岩、陈锐、朱珠、王成、徐石勇。本标准 2016年9月首次发布。IDB12/T 653—2016鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测实时荧光 PCR法1范围本标准规定了鲜冻畜、禽肉中动物源性成分（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）的定量 PCR检测方法的术语和定义、检测方法、结果计算。本标准适用于生鲜、冷冻畜禽肉中动物源性成分的定量 PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光 PCRreal time PCR实时荧光 PCR是指PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，对未知模板进行定性或定量分析。3.2Ct值 cycle time每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.3内参基因reference gene能够同时检测出多种动物源性成分的基因（包括牛、羊、猪、鸡、鸭等）。3.43.53.63.73.8牛源性成分bovine-derived materials牛种属特异性 DNA片段。羊源性成分ovine-derived materials羊种属特异性 DNA片段。猪源性成分porcine-derived materials猪种属特异性 DNA片段。鸡源性成分chicken-derived materials鸡种属特异性 DNA片段。鸭源性成分duck-derived materials鸭种属特异性 DNA片段。1DB12/T 653—20164原理根据牛、羊、猪、鸡、鸭等的DNA特征序列，筛选种间保守区域设计一对通用引物和种内特异性区域设计五对种属特异性引物，通用引物可同时扩增牛、羊、猪、鸡、鸭等多种动物源性 DNA，采用 TaqMan实时荧光 PCR技术，根据标准参照物模板含量与Ct值间的线性关系，绘制标准曲线，计算试样中种属特异性基因和内参基因的比值，从而对鲜冻畜、禽肉中动物源性成分进行定量检测。5检测方法5.1试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682规定的一级水。DNA提取用试剂5.1.1三氯甲烷；异戊醇；乙酸钠；无水乙醇；Tris饱和酚；裂解液：10mmoL/LTris-HCl（pH 8.0），25 mmol/L EDTA（pH8.0），5 g/L SDS，0.1 g/L蛋白酶 K；TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10 mmoL/LTris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。5.1.25.1.3TaqMan荧光PCR反应试剂盒引物和探针。表1动物源性成分内参基因和种属特异性基因引物和探针序列检测基因引物序列扩增片段长度基因性质内参基因16S-F：5′- ACCGTGCAAAGGTAGCATAATCA -3′16S-R：5′- GCTCCATAGGGTCTTCTCGTCTT-3′16S-P：5′- FAM- ACTTGTATGAATGGCCGCAC