ICS 11.220B 41 团体标准T/CVMA 5—2018非洲猪瘟病毒实时荧光 PCR检测方法Real-time PCR assay for detection of African swine fever virusCVMA中国兽医协会2018 - 10 - 24发布2018 - 10 - 24实施中 国 兽 医 协 会发布T/CVMA5—2018前言本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草本标准由中国兽医协会提出并归口本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心中国兽医药品监察所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国农业科学院兰州兽医研究所北京海关本标准主要起草人：倪建强王传彬王琴仇华吉殷宏杨林辛盛鹏刘艳华刘洋宋晓晖赵启祖罗玉子刘志杰张乾义乔彩霞夏应菊杨吉飞徐璐顾小雪亢文华李硕毕一鸣CVMA中国兽医协会IT/CVMA5—2018非洲猪瘟病毒实时荧光 PCR检测方法1范围本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂仪器和耗材操作步骤结果判定实验室生物安全等技术要求本标准适用于猪脾脏淋巴结血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB 19489实验室生物安全通用要求NY/T 541兽医诊断样品采集保存与运输技术规范3试剂3.1DNA提取试剂DNA提取试剂的配制见附录A或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取CVMA3.22 × PCR缓冲液中国兽医协会2× PCR缓冲液的配制见附录A3.3引物探针3.3.1采用针对非洲猪瘟病毒 VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'3.3.2可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Testsand Vaccines for Terrestrial Animals）第 2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'1T/CVMA5—2018下游引物ASF-OIE-rPCRR：5'-1857-ACGGCNGATCTTGTGGTATC-1876-3'荧光探针ASF-OIE-Probe：5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'3.3.3使用国家农业行政主管部门批准的其他引物探针应对检测程序和判定标准作相应调整3.4阴性及阳性对照阴性及阳性对照的制备方法见附录C其他试剂3.5消毒液5U/μL Taq DNA聚合酶无菌无核酸酶水0.01mol/L PBS（pH7.2）消毒液配制见附录A 0.01mol/L PBS配制见附录A4仪器和耗材分析天平（感量0.1 mg）高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12 000 r/min）冰盒实时荧光PCR仪及配套反应管（板）组织研磨器-20℃冰箱可调移液器（2 μL20 μL200 μL 1000μL）1.5 mL离心管（无核酸酶）5操作步骤5.1样品采集及运输样品采集及运输按照NY/T541的规定执行采集猪的脾脏淋巴结血液等组织材料或血粉用于检测样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室避免反复冻融采样时应穿戴个人生物安全防护装备实CVMA施现场消毒和废弃物处理中国兽医协会5.2样品处理检测前样品应在二级生物安全柜中处理取 0.1g0.2g组织或血粉经研磨破碎后加 1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）制成匀浆经10 000 r/min离心取上清；全血血清样品直接取1