文本描述
中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准犛犖／犜２４６２ —２０１０棉 花 曲 叶 病 毒 检 疫 鉴 定 方 法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀 狅犳犮狅狋狋狅狀犾犲犪犳犮狌狉犾犅犲犵狅犿狅狏犻狉狌狊２０１００１１０ 发 布２０１００７１６ 实 施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 犛犖／犜 ２４６２ —２０１０前 言本 标 准 的 附 录 Ａ为 资 料 性 附 录。本 标 准 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出并 归 口。本 标 准 起 草 单 位 ：中 华 人 民 共 和 国 新 疆 出入 境 检 验 检 疫 局 、浙 江 大 学 、中 国 检 验 检 疫 科 学 研 究 院。本 标 准 主 要 起 草 人 ：张 祥 林 、周 雪 平 、朱水 芳 、王 翀 、吴 卫 、余 永 杰。本 标 准 系 首 次 发 布 的 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标准。Ⅰ 犛犖／犜 ２４６２ —２０１０棉 花 曲 叶 病 毒 检 疫 鉴 定 方 法１ 范 围本 标 准 规 定 了 棉 花 曲 叶 病 毒 （ＣｏｔｔｏｎｌｅａｆｃｕｒｌＢｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ，简 称 ＣＬＣｕＶ）的检 疫 鉴 定 方 法。本 标 准 适 用 于 可 能 带 有 棉 花 曲 叶 病 毒 的 活 体寄 主 植 物 的 检 疫 鉴 定。２ 原 理棉 花 曲 叶 病 毒 的 分 类 地 位 属 于双 生 病 毒 科 （Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、菜豆 金 色花 叶 病 毒 属 （Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ）。该 病 毒 的 生 物 学 特 性 、血 清 学 特 性 和 分 子生 物 学 特 征 是 制 定 本 标 准 的 主 要 依 据 （参 见 附 录Ａ）。３ 仪 器 设 备 和 用 具３．１ 仪 器 设 备电 子 天 平 （感 量 １／１ ０００ ｇ）、超净 工 作 台 、高 速 冷 冻 离 心 机 、小 型 低 速 离 心 机 、ｐＨ计 、恒 温 水 浴 锅 、微量 榨 汁 机 、超 低 温 冰 箱 、高 压 灭 菌 器 、酶标 仪 、ＰＣＲ仪 、电 泳 仪 、电 泳 槽 、凝 胶 成 像 分 析 仪 等。３．２ 用 具研 钵 、培 养 皿 、可 调 式 微 量 移 液 器 （２ μＬ 、１０ μＬ 、２０ μＬ 、１００ μＬ 、２００ μＬ 、１ ０００ μＬ ）及 相应 的 移 液 器头 、９６ 孔 酶 联 反 应 板 、离 心 管 （１．５ｍＬ 、１０ ｍＬ）、ＰＣＲ管 （０．２ ｍＬ ）、量 筒、烧 杯 、镊 子。４ 试 剂 、缓 冲 液 及 溶 液４．１ １０× 犘犅犛犜缓 冲 液 氯 化 钾 （ＫＣｌ）２ｇ、氯 化 钠 （ＮａＣｌ）８０ｇ、磷酸 二 氢 钾 （Ｋ Ｈ ２ＰＯ ４）２ ｇ、磷酸 氢 二 钠 （Ｎａ２ＨＰＯ ４ ·１２ Ｈ ２Ｏ）１１ ．５ ｇ、吐 温 ２０ （Ｔｗｅｅｎ２０ ）５ ｍＬ ，用浓 盐 酸 （ＨＣｌ）调节 ｐＨ至 ７．４，加蒸 馏 水 定 容 至 １ ０００ ｍＬ ，４ ℃ 条 件下 贮 存。４．２ 样 品 提 取 缓 冲 液亚 硫 酸 钠 （Ｎａ２ＳＯ３ ）１．３ ｇ、聚乙 烯 基吡 咯 烷 酮 （Ｍ Ｗ ２４ ０００ ～ ４０ ０００ ，ＰＶＰ ）２０ ｇ、叠氮 钠 （ＮａＮ ３）０．２ ｇ、吐温 ２０ （Ｔｗｅｅｎ２０ ）２０ ｍＬ溶 解 于 ８００ ｍＬ１× ＰＢＳＴ中 ，用 盐 酸 调 节ｐＨ至 ７．４，加１ × ＰＢＳＴ定容 至 １ ０００ ｍＬ ，４ ℃ 条 件 下贮 存。４．３ 包 被 缓 冲 液碳 酸 钠 （Ｎａ２ＣＯ ３）１．５９ｇ、碳 酸 氢 钠 （ＮａＨＣＯ３ ）２．９３ ｇ、叠氮 钠 （ＮａＮ ３ ）０．２ ｇ，用浓 盐 酸 （ＨＣｌ）调 节至 ９．６，加蒸 馏 水 定 容 至 １ ０００ ｍＬ，４ ℃ 条 件 下 贮 存。ｐＨ４．４ 洗 涤 缓 冲 液将 １× ＰＢＳＴ缓 冲 液用 浓 盐 酸 （ＨＣｌ）调节 ｐＨ至 ７．４，４℃ 条 件 下 贮 存。４．５ 酶 标 抗 体 缓 冲 液１× ＰＢＳＴ缓 冲 液 ８００ｍＬ 、小 牛 血清 白 蛋 白 （ＢＳＡ）２ ｇ、聚乙 烯 基 吡 咯 烷酮 ２０ ｇ、叠氮 钠 （ＮａＮ３）０．２ ｇ，用无 菌 蒸 馏 水 定 容 至 １ ０００ ｍＬ ，４℃ 条 件 下 贮 存。４．６ 底 物 （犘犖犘犘）缓 冲 液二 乙 醇 胺 ９７ ｍＬ 、叠氮 钠 （ＮａＮ ３ ）０．２ ｇ，用浓盐 酸 （ＨＣｌ）调节ｐＨ至 ９．８，用无菌 蒸 馏 水 定 容至１ ０００ ｍＬ ，４ ℃ 条 件 下 贮 存 。４．７ 底 物 （犘犖犘犘）溶 液将 ４硝 基 酚 磷 酸 钠盐 （ＰＮＰＰ）１００ ｍｇ 溶 解 于 ＰＮＰＰ 底 物 缓 冲 液 １００ ｍＬ中 ，现 配 现 用。１ 犛犖／犜 ２４６２ —２０１０４．８ 终 止 反 应 液氢 氧 化 钠 （ＮａＯ Ｈ ）４０ ｇ，用无 菌 蒸 馏 水 定 容 至 １ ０００ ｍＬ。４．９ 提 取 缓 冲 液犃葡 萄 糖 ６０ ｇ、ＮａＤＩＥＣＡ ２３ ｇ、聚乙 烯 基 吡 咯 烷 酮 ２０ ｇ、巯基 乙 醇 ０．８ ｍＬ ，溶解 于 １ ０００ ｍＬ 蒸 馏水中 ，常 温 下 贮 存。４．１０ 提 取 缓 冲 液犅１０ ｍ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ盐酸 、２０ ｍ ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ、０．５ｍｏｌ／Ｌ 氯 化 钠 、１．５％ＳＤＳ，ｐＨ８．０。４．１１ １０ × 犘犆犚缓 冲 液１０ ｍ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ盐酸 ，１０ ｍ ｍｏｌ／Ｌ４．１２ 犜犃犈电 泳 缓 冲 液氯 化 钾。４０ ｍ ｍｏｌ
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