ICS11. 220 DB21B41 辽 宁省地方标准DB 21/ T2326—2014猪伪狂犬病毒实时荧光 PCR检测方法Method of real time fluozescentPCR for the detection of pseudorabies virus2014 -07 -05发布2014 -09 -05实施辽宁省质量技术监督局发布 DB21/ T2326—2014 前言本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：陈瑶、赵晓彤、于学武、赵凤菊、于长泳、张雅为、刘坤洋、杨国丽、邓文超、高志峰、关淼、李连昭、杨松柏I DB21/ T2326—2014 猪伪狂犬病毒实时荧光 PCR检测方法1 范围本标准规定了猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）gG和gE基因的荧光PCR检测方法的实验技术要求。本标准适用于 PRV的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪脏器、血液和细胞培养物中PRV核酸的检测，以及根据免疫背景对 gE基因缺失疫苗毒与野毒感染的鉴别检测。本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范3 缩略语下列缩略语适用于本标准。PRV：猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus）HS Taq酶：热启动Taq DNA聚合酶(HS Taq DNA polymerase) Ct值：达到阈值的循环数(cycle threshold) DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) 荧光 PCR：荧光聚合酶链式反应( real time fluozescent quantitative polymerase chain reaction) PBS：磷酸缓冲液（phosphate buffer solution）4 原理SYBR GreenⅠ是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，能与通过PCR反应产生的双链DNA非特异?性结合，结合后发出荧光，通过检测反应体系中SYBR?GreenⅠ荧光强度，同时测定扩增产物DNA的熔解温度，分析PCR扩增产物的单一性，以达到检测PCR产物扩增量的目的。5 仪器和器材5. 1 仪器分析天平、高速离心机、荧光 PCR扩增仪、-70℃冰箱、-20℃冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程为 2μL，20μL，200μL，1000μL）。5. 2 器材1 DB21/ T2326—2014 组织匀浆器或研钵、眼科剪、眼科镊、10 mL一次性注射器、1.5 mL灭菌离心管、PCR八联排管或 96孔板、吸头（10μL，200μL，1000μL）、灭菌双蒸水、称量纸。6 试剂和材料6. 1DNAzol? Reagent：DNA抽提试剂，外观为淡绿色，于4 ~8 ℃保存。6. 2SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time）：SYBR? GreenⅠ嵌合荧光法进行Real Time PCR反应的专用试剂，为 PCR Buffer、dNTP、RNaseH、HS Taq酶以及SYBR? GreenⅠ染料的预混液，于-20长期保存，融化后于 4 ℃～8 ℃保存。℃6. 3PBS：磷酸盐缓冲液（0.02 mol/LpH7.2）。6. 4 无水乙醇：-20℃预冷。6. 575%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。6. 6 阴性对照：灭菌双蒸水。6. 7 阳性对照：PRV细胞培养物。注：本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。7 操作步骤7. 1 样品的采集、前处理、存放和运送7. 1. 1 采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7. 1. 2 采样工具药匙、15 mL离心管和1.5 mL离心管经121（±2）℃高压灭菌 15 min；剪刀、镊子经 160 ℃干热灭菌 2 h。7. 1. 3 内脏样品的采集与前处理采取病死或剖杀猪主要脏器（脑、淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏）装入灭菌 15 mL离心管中，编号，送实验室。取 100 mg左右待检样品，按1:5倍体积加入PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，1 000 g离心15 min，取上清液，转入 1.5 mL离心管中编号备用。7. 1. 4 血液样品的采集与处理用无菌注射器采集血液，注入含1/104% EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备用。7. 1. 5 细胞培养物细胞培养物冻融 3次，转入1.5 mL离心管中编号备用。7. 1. 6 存放与运送2 DB21/ T2326—2014 采集或处理的样品在 2~8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70 ℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过 3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6~8 h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7. 2 实时荧光PCR检测7. 2. 1DNA提取在核酸提取室进行。7. 2. 1. 1 取n个灭菌的1.5 mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行编号。7. 2. 1. 2 每管加入800 μL DNAzol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各 200 μL，颠倒 10次混匀，室温静置 5 min；4℃ 10 000 g离心10 min。7. 2. 1. 3 取900μL上清，置新的 1.5mL灭菌离心管中，加入500 μL无水乙醇，混匀，室温放置3 min；4℃ 10 000 g离心5min。7. 2. 1. 4 弃上清，沿管壁缓缓加入1mL 75%乙醇，混匀，4℃ 10 000 g离心5min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干（以无