ICS11. 220 DB21B41 辽 宁省地方标准DB 21/ T2323—2014亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒 RT- PCR检测方法Method of RT-PCR for thedetection of type Asia 1 foot and mouth diseasevirus2014 -07 -05发布2014 -09 -05实施辽宁省质量技术监督局发布 DB21/ T2323—2014 前言本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：杨本勇、曹东、李井春、王宏燕、李树博、段亚良、刘坤洋、何利昆、王军、丁静、张鑫、王芬、王海波1 DB21/ T2323—2014 亚洲 I型口蹄疫病毒 RT- PCR检测方法1 范围本标准规定了亚洲I型口蹄疫病毒（FMDV- Asia I）RT-PCR检测方法的实验材料、仪器设备、试剂、操作步骤和结果判定，并介绍了其原理。本标准适用于动物及动物产品中亚洲I型口蹄疫病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法兽医实验室生物安全技术管理规范3 缩略语下列缩略语适用于本标准。DEPC（diethypyocarbonate）RNA(ribonucleicacid)焦炭酸二乙酯核糖核酸RT-PCR(reverse transcription-PCR) dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate) bp(base pair) 反转录聚合酶链反应脱氧核苷酸三磷酸碱基对Ｏ-P液(oesophagus-pharyngeal) EB（Ethidium bromide）牛、羊食道-咽部分泌物溴化乙锭FMDV-Asia I（Foot-and-mouth disease virus serotype Asia I）亚洲I型口蹄疫病毒4 原理FMDV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据FMDV- Asia I保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5 实验材料、仪器设备和试剂5. 1 实验材料眼科剪、眼科镊、称量纸、1.5 mL灭菌离心管（经DEPC水处理）、0.2 mL薄壁PCR管、500 mL量筒、500mL三角瓶、吸头（10μL、200 μL、1000μL）。2 DB21/ T2323—2014 5. 2 仪器设备分析天平、低温高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、-70 ℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20 ℃冰箱、可调移液器（最大量程分别为2 μL、20 μL、200 μL、1000 μL）。5. 3 试剂5. 3. 12.5 mmol/L dNTP。5. 3. 2 引物：上游引物5′-GCGCTCGTCCACACAGGACCGG-3′, 下游引物5′-CATGTCCTCTTGCATCTGGTT-3′。5. 3. 310倍PCR缓冲液。5. 3. 41%溴化乙锭（EB）溶液（见第 A.1）。5. 3. 5 电泳缓冲液（50倍）（见第 A.2）。5. 3. 61%琼脂糖凝胶（见第 A.3）。5. 3. 775%乙醇（见第 A.4）。5. 3. 8 灭菌DEPC水（见第A.5）。5. 3. 9 上样缓冲液(见第A.6)。5. 3. 10 电泳缓冲液（1倍）（见第 A .7）。5. 3. 11 磷酸盐缓冲液（0.04mol/L 、pH 7.4）（见第 A .8）。5. 3. 12 其他试剂：10 U/μL AMV反转录酶、50 U/μL RNA酶抑制剂、5 U/μL Taq DNA聚合酶、异丙醇、25 mmol/L氯化镁溶液。注：除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682-2008的灭菌双蒸水或超纯水。6 操作步骤6. 1 样品的采集、保存运送和处理6. 1. 1 样品采集6. 1. 1. 1 水泡液：未破裂水泡中的水泡液用灭菌注射器吸出后装入灭菌小瓶中（可加青霉1000UI/mL，链霉素 1 mg/mL），加盖密封，编号。6. 1. 1. 2 水泡皮：剪取新鲜水泡皮3～5 g放入灭菌小瓶中，加6～10 mL（2倍体积）50％甘油－磷酸盐缓冲液(0.04 mol/L 、pH7.4), 加盖密封，编号。6. 1. 1. 3 组织样品：无菌采集淋巴结、脊髓等组织样品3～5g装入洁净的小瓶内或其他灭菌容器，编号。3 DB21/ T2323—2014 6. 1. 1. 4O-P液样品：被检动物在采样前禁食(可饮水)12 小时，以免反刍胃内容物严重污染 O-P液。采样探杯在使用前经 0.2％柠檬酸或 2％氢氧化钠浸泡 5 min，再用自来水冲洗。每采完一头动物,探杯要重复进行消毒和清洗。采样时动物站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部 10～15 cm处，轻轻来回移动 2～3 次，然后将探杯拉出。如采集的O-P液被反刍胃内容物严重污染，要用生理盐水或自来水冲洗口腔后重新采样。将探杯采集到的 8～10 mL O-P液倒入25 mL以上的灭菌玻璃容器中, 容器中事先加有 8～10 mL细胞培养液或磷酸盐缓冲液 (0.04 mol/L 、pH7.4)，加盖密封后充分摇匀，编号。6. 1. 2 样品保存与运送6. 1. 2. 1 样品保存：采集的样品冷藏送检或尽快冷冻保存，避免反复冻融。6. 1. 2. 2 样品运送：样品装入保温壶或保温桶中加冷冻剂和防震材料，加盖密封，以最快方式，运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。6. 1. 3 样品处理6. 1. 3. 1 水疱液：不需处理，可以直接进行核酸提取。6. 1. 3. 2 水