ICS11. 220 DB21B41 辽 宁省地方标准DB 21/ T2327—2014猪圆环病毒 2型实时荧光PCR检测方法Method of real time fluozescent PCRfor the detection of porcine circovirus type 22014 -07 -05发布2014 - 09 -05实施辽宁省质量技术监督局发布 DB21/ T2327—2014 前言本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：于学武、顾贵波、赵晓彤、崔基贤、陈瑶、魏澍、马建山、王竹、申贯男、赵凤菊、李璐、李晓楠、于丹、王海丰I DB21/ T2327—2014 猪圆环病毒 2型实时荧光PCR检测方法1 范围本标准规定了猪圆环病毒 2型（porcine circovirus type 2，PCV2）实时荧光PCR检测方法的实验技术要求。本标准适用于 PCV2的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪脏器、血液、排泄物和细胞培养物中PCV2核酸的检测。本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范3 缩略语下列缩略语适用于本标准。PCV2：猪圆环病毒 2型（porcine circovirus type 2）HS Taq酶：热启动Taq DNA聚合酶（HS Taq DNA polymerase）Ct值：达到阈值的循环数（cycle threshold）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）实时荧光 PCR：荧光聚合酶链式反应（real time fluozescent quantitative polymerase chain reaction）PBS：磷酸缓冲液（phosphate buffer solution ）4 原理根据 PCV2基因特定序列的保守片段，合成一对特异性引物和一条特异性探针。荧光探针的5’端标记 FAM荧光素，3’端标记TAMRA荧光素，3’端的淬灭基团在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号。但在扩增时，由于 Taq酶的5’→3’的外切活性，在延伸到荧光探针时，将探针切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生。因此，可通过检测荧光信号对核酸进行检测。5 仪器和器材5. 1 仪器主要仪器有分析天平、高速离心机、荧光 PCR扩增仪、-70℃冰箱、-20℃冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程为 2μL，20μL，200μL，1000μL）。1 DB21/ T2327—2014 5. 2 器材主要器材有组织匀浆器或研钵、眼科剪、眼科镊、10 mL一次性注射器、1.5 mL灭菌离心管、PCR八联排管或 96孔板、吸头（10μL，200μL，1000μL）、灭菌双蒸水、称量纸。6 试剂和材料6. 1DNAzol? Reagent：DNA抽提试剂，外观为淡绿色，于4～8℃保存。6. 2Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）：TaqMan探针法进行Real time PCR反应的专用试剂，为 PCR Buffer、dNTP、RNaseH和HS Taq酶的预混液，于-20℃长期保存，融化后于4～8 ℃保存。6. 3PBS：磷酸盐缓冲液（0.02 mol/LpH7.2）。6. 4 无水乙醇：-20℃预冷。6. 575%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。6. 6 阴性对照：灭菌双蒸水。6. 7 阳性对照：PCV2细胞培养物。注：本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。7 操作步骤7. 1 样品的采集、前处理、存放和运送7. 1. 1 采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7. 1. 2 采样工具药匙、15 mL离心管和1.5 mL离心管经121（±2）℃高压灭菌 15 min；剪刀、镊子经 160℃干热灭菌 2 h。7. 1. 3 内脏样品的采集与前处理采取病死或剖杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝脏）装入灭菌 15mL离心管中，编号，送实验室。取 100mg左右待检样品，按1:5倍体积加入PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，1 000 g离心15 min，取上清液，转入 1.5 mL离心管中编号备用。7. 1. 4 血液样品的采集与处理用无菌注射器采集血液，注入含1/10 4% EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备用。7. 1. 5 粪便的采集与前处理2 DB21/ T2327—2014 用药匙采取猪新鲜粪便，装入 15 mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入PBS，混匀，1 000g离心15 min，取上清液，转入 1.5 mL离心管中编号备用。7. 1. 6 细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入1.5 mL离心管中编号备用。7. 1. 7 存放与运送采集或处理的样品在 2~8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70 ℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过 3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6~8 h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7. 2 实时荧光PCR检测7. 2. 1DNA提取在核酸提取室进行。7. 2. 1. 1 取n个灭菌的1.5 mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行编号。7. 2. 1. 2 每管加入800 μL DNAzol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各 200 μL，颠倒 10次混匀，室温静置 5 min；4℃ 10 000 g离心10 min。7. 2. 1. 3 取900μL上清，置新的 1.5 mL灭菌离心管中，加入500μL无水乙醇，混匀，室温放置3 min；