-2 - ABSTRACT -6- 缩略语表 -11 - 前言 -12 - 材料和方法 -14 - -:实验賴 -14- 二:标本收集与处理 -15- 三:ELISA法测定外周血ANNENXINA3蛋白表达 -15- 四:统计学处理 -21- 实验结杲 -22- 第一部分:研究对象的一般资料 -22- 第二部分:ANNEXINA3蛋白在人外周血中的表达 -26- 1.实验的质量控制检验 -26- 2. EUSA法检测AnnexinA3的结果判读. -29 - 3. Annexin A3蛋白在人外周血中的水平 -36 - 第三部分:ANNEXIN A3蛋白水平在人外周血的表达 -37- 1. Annexin A3在健康妇女中的表达 -37 - 2. Annexin A3在卵巢良性肿瘤患者中的表达 -37 - 3. Annexin A3在卵巢癌患者中的表达 -38 - 第四部分:Annexin A3蛋白与卵巢癌耐药相关性分析 -44- 讨论 -46 - 第一部分:ANNEXINA3外泌机制的探讨 -46 - 第二部分:研究对象的选择 -48- 第三部分:ELISA法临床检验外周血ANNEXIN A3表达方法学探讨 -49 - 第四部分:实验结果的讨论 -52- 全文小结 -53 - 致谢 -54 - 参考文献 -56 - 附:《卵巢癌资料登记表》 摘要 背景和目的: 卵巢癌是妇科肿瘤首位致死性疾病,晚期患者的5年生存率始终徘徊在20%30%,肿瘤细胞对于化疗药物产生耐药性是造成这一状况的主要原因之一。钼类是 治疗卵巢癌的一线化疗药物,临床对于卵巢癌铂类药物耐药巳有明确的认识和定 义,但对其耐药性产生机制的认识相对处于初级阶段,进一步预测钼类化疗耐药的 工作则更是刚刚起步。 本课题组自2003年起开展对卵巢上皮癌铂类化疗耐药相关蛋白的研究,运用 比较蛋白质组学技术筛选出铂类化疗耐药相关蛋白AnnexinA3。经免疫组织化学验 证,AnnexinA3在临床卵巢癌钼类耐药患者的肿瘤组织中表达明显升高,AnnexinA3 高表达组患者的无瘤生存期显著缩短。动物试验表明,AnnexinA3高表达细胞,在 顺拍作用后裸鼠中成瘤率明显上升。运用质粒转染技术,上调AnneXinA3的表达后, 发现Annexin A3能够降低细胞内铀含量及铂-DNA结合量。Annexin A3高表达的细 胞对铀类化疗药物的耐药性显著增强,但是对紫杉醇、表阿霉素等药物无交叉耐药 性,提示ArmeXinA3可能是铂类特异性耐药相关蛋白。进一步的研究发现,在卵巢 上皮癌细胞系的培养基上清中有AnnexinA3蛋白表达,其强度与细胞内AnnexinA3 的表达水平呈正相关。体内实验在临床卵巢癌患者的外周血中也检测出AnneXinA3 蛋白的表达,充分证实AnnexinA3是一个可分泌蛋白。 本研究旨在前期工作的基础上探讨利用ELISA法在外周血定量检测Annexin A3蛋白的可行性。分析Annexin A3蛋白在正常妇女、卵巢良性肿瘤患者及卵巢癌 患者外周血中的分布及表达水平’并初步探讨卵巢癌患者外周血表达水平与卵巢癌 铂类耐药的相关性。 方法: 1.研究对象:连续入选于2009年12月至2010年2月期间在北京协和医院体 检及就诊的健康妇女、卵巢良性肿瘤和卵巢癌患者。 健康妇女入选标准:纳入妇科体格检查、宫颈细胞学检查及妇科超声检查均无 异常,并同时进行了血清CA125检测的妇女,排除既往有卵巢肿瘤或妇科及全身恶 性肿瘤的妇女。年龄与卵巢癌患者匹配。 卵巢良性肿瘤入选标准:在北京协和医院住院手术治疗的患者,病理诊断明确, 术前进行了血清CA125检测。 卵巢癌患者入选标准:在北京协和医院妇产科治疗及随诊,病理诊断为卵巢原 发上皮癌,进行了血清CA125的检测,排除合并其它妇科或全身恶性肿瘤的患者。 卵巢癌耐药病例包括耐药性和难治性卵巢癌。耐药性卵巢癌为,初次化疗有效,但 停化疗6个月以内肿瘤复发。难治性卵巢癌为,初次化疗时疾病进展或持续存在。 将二者作为铂耐药性卵巢癌。 2.标本及临床资料收集:全部标本来自北京协和医院进行血清CA125检测的剩 余血清,检测后刊。C冷库内保存。7天之内将血清样本分装到0.5mLEppendorf中, 转移至-80°C冰箱冻存。在测量前半小时一次化冻。详细记录同一样本的血清CA125 水平以及所有对象相应的临床资料。 3.釆用ELISA方法检测上述样本外周血清AnnexinA3的浓度。每份样本设3个 复孔,取均值求得测定值。对于检测过程的质量控制措施包括:制定标准的操作程 序,培训操作人员,一次性完成测定,在临床检验专家的指导下设置标准品和标准 曲线,随机插入已知蛋白浓度的质控品,被检样品的随机上样,以及釆用双波长测 定吸收值等。 4.采用回顾性分析的方法,分层分析临床卵巢上皮癌化疗敏感和耐药病例的各 生物学变量与AnnexinA3蛋白表达水平的相关性;分析卵巢上皮癌患者的无销化疗 间期与Annexin A3蛋白表达水平的相关性。 5.采用SPSS17.0软件进行统计学分析。利用Crubbs氏法对ELISA测定进行质控 检验。Kolmogorov-Smirnov非参数检验进行质控品光密度及样本的正态性检验。 两组正态分布独立样本比较采用t检验。两组非正态分布独立样本比较利用 Mann-Whitney非参数检验。多组非正态分布独立样本比较利用Kruskal-Wallis非参数 检验。 研究结果: 1.连续收集病例共计271例。其中,健康妇女102例,年龄范围31 — 78岁,中位 年龄52岁。卵巢良性肿瘤患者47例,年龄范围17—61岁,中位年龄36岁。卵巢癌患 者122例,包括化疗敏感病人63例,耐药病人59例;年龄范围31 — 81岁,中位年龄 53岁。卵巢癌患者与健康妇女的年龄无显著性差异;与卵巢良性肿瘤患者的年龄有 显著性差异(p<0.05)。 2.271份标本共使用10个96孔板。经Crubbs氏法质控检验,第19板符合质控要 求,第10板不符合质控要求。舍弃板10数据,共计26份标本,包括卵巢良性肿瘤8 例以及健康妇女18例。Kolmogorov-Smirnov检验对质控品光密度进行正态性检验, 三个浓度p值分别为0.919, 0.751,0.931,均符合正态分布。并去除标准曲线以外的 极端大值6例和极端小值8例。 3.在临床全部271份的血清样本中均可以检测到Annexin A3蛋白的表达。去 掉极端值及质控不合格值后,共有样本231份进行统计分析。经Kolmogorov-Smirnov 检验,卵巢良性肿瘤患者Annexin A3测定值为正态分布,p=0.387。健康妇女和卵 巢癌患者AnnexinA3非正态分布,p值分别为0.028, 0.007。在健康妇女血清中的 Annexin A3 表达范围在 0.261-4.74ng/mL,平均值 0.867ng/mL,中位数 0.709ng/mL。卵巢良性肿瘤患者Annexin A3蛋白的表达范围在0.263-2.46ng/mL, 平均值0.815ng/mL,中位数0.740ng/mL。卵巢癌患者Annexin A3蛋白的表达范围 在 0.201-2.84ng/mL,平均值 0.689ng/mL,中位数 0.567ng/mL。经 Kruskal-Wallis 检 验,三组相比无显著性差异。分析研究对象血清Annexin A3的表达水平与CA125 测定值的相关性。将健康妇女血清CA125值分为<10U/mL和彡10U/mL两组, Annexin A3的表达水平无明显差别。将卵巢良性肿瘤患者血清CA125值分为< 35U/mL和》35U/mL两组,Annexin A3的表达水平也无明显差别。将卵巢癌患者 血清CA125值分为〈100U/mL和彡100U/mL两组,前者的Annexin A3的测定平 均值为0.645 ng/mL,后者平均值为0.840 ng/mL,两组的表达水平有显著性差别(p =0.043)。 4.根据卵巢上皮癌患者末次化疗的时间将研究对象分为化疗敏感和耐药两组。 按照患者的年龄、血清CA125水平、FIGO分期、肿瘤的病理学类型、分化程度、 以及铂化疗的疗程总数等生物学变量进行分层,两组之间Annexin A3蛋白的表达 水平均未达到统计学上的显著性差别。进一步根据卵巢癌患者末次铂类化疗的时间 统计无铀化疗间期,分为<6个月和〉6个月两组,按照Annexin A3的表达水平的 测定值分层,取所采用试剂盒建议的标曲范围最小值0.8ng/mL为上限,以0.2ng/mL 为一个层间距,至试剂盒的最小分辨度为0.2ng/mL为下限,共分为4层。分析表 明,伴随分层Annexin A3基础数值的递增,两组Annexin A3测定值的的平均值和 中位数平行线性上升。至Annexin A3^0.6ng/mL层时,两个组Annexin A3表达水 平同步进入正态分布区间,采用t检验对两组间的平均值进行比较。在Annexin A3 彡0.6ng/mL层,Annexin A3的均值,无钿化疗间期彡6个月组为1.17±0.615ng/mL; 〉6 个月组为 0.924±0.250 ng/mL, p=0.048。在 Anneixn A3X).8ng/mL 层,Annexin A3的均值,无铂化疗间隔彡6个月组为1.44±0.647ng/mL; >6个月组水平为 1.07±0.214 ng/mL, p=0.028。由于两组的方差齐性检验p值均<0.05,进一步采用t’ 检验,获得对Annexin A3均值检验的p值,在Annexin A3X).6ng/mL层,p=0.095; 在Annexin A3彡0.8ng/mL层,p=0.070;统计学十分接近显著性差别。 结论: 1.本研究首次连续收集较大量的临床标本开展卵巢癌铂类耐药相关蛋白 Annexin A3在人外周血中检测的研究。共收集健康妇女102例,卵巢良性肿瘤患者 47例,卵巢癌患者122例,共计271例研究对象。 2.采用ELISA法可以完成对Annexin A3蛋白在人外周血清中表达的高通量定 量检测。在临床全部271份的血清样本中均检测到AnnexinA3蛋白的表达,健康妇 女和卵巢癌患者AnnexinA3非正态分布。有超过150例标本的测定值低于建议标曲 范围的最小值0.8ng/mL,表明现有ELISA试剂盒的敏感性欠佳。开发更加敏感的 检测方法可以完善对AnnexinA3蛋白在人外周血中检测的研究。 3.现有样本中,AnnexinA3蛋白在健康女性、卵巢良性肿瘤患者和卵巢上皮癌 患者外周血清中的表达无显著性差异。AnnexinA3蛋白的表达与健康女性和卵巢良 性肿瘤患者外周血中CA125水平无明显相关性;而与卵巢上皮癌患者外周血中高水 平CA125的表达有关,提示AnneXinA3蛋白可能是卵巢癌特异性相关蛋白。本研 究中卵巢癌患者Annexin A3蛋白的测定值在直观上低于健康女性和卵巢良性肿瘤 患者,可能与前者均为术后化疗或化疗后随访的病例,其肿瘤负荷大大降低有关。 检测卵巢癌患者术前或化疗前血清Annexin A3蛋白水平将有助于证明Annexin A3 蛋白能否成为卵巢癌铂类耐药标记蛋白。 4.本研究表明,根据卵巢上皮癌患者末次化疗的时间将研究对象分为化疗敏感 和耐药两组,按照患者的年龄、血清CA125水平、FIGO分期、肿瘤的病理学类型、 分化程度、以及铂化疗的疗程总数等生物学变量进行分层,两组之间Annexin A3 蛋白的表达水平均未达到统计学上的显著性差别。根据卵巢癌患者末次钼类化疗的 时间统计无铂化疗间期,分为<6个月和〉6个月两组,按照Annexin A3的表达水 平的测定值分层,结果表明,在Annexin A3>0.6ng/mL层时,其表达水平在<6个 月组升高,统计学十分接近显著性差别。提示Annexin A3极有可能是一种卵巢癌 铂类耐药特异性相关蛋白,可以通过增加样本的数量完善研究结论。