犐犆犛５９．１４０．３０ 犢４６ ! " # $ % & ' ' ( ) * 犌犅／犜３８４２１—２０１９ !"　#$%&'(　)*+,-$ ./01234（犘犆犚）'(56 犉狌狉—犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犪狀犻犿犪犾犱犲狉犻狏犲犱犿犪狋犲狉犻犪犾—犙狌犪犾犻狋犪狋犻狏犲狉犲犪犾狋犻犿犲 狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀（犘犆犚）犿犲狋犺狅犱狊 ２０１９１２３１78 ２０２００７０１)9 ' ( + , - . / 0 1 2 ' ( ) * 3 / 0 4 5 6 7 8 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。 本标准由中国轻工业联合会提出。 本标准由全国皮革工业标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ２５２）归口。 本标准起草单位：广州检验检测认证集团有限公司、国家皮革质量监督检验中心（浙江）、深圳华大 基因科技服务有限公司、浙江方圆检测集团股份有限公司、中国皮革制鞋研究院有限公司、陕西科技大 学、中国计量大学、东莞市惟思德科技发展有限公司。 本标准主要起草人：覃芳芳、黄新霞、孙海陆、陈宗良、王学川、冯爱明、张弛、孙霞、赵洋、章文福。 Ⅰ 犌犅／犜３８４２１—２０１９ 毛皮　源性成分检测　实时荧光定性 聚合酶链式反应（犘犆犚）检测方法 １　范围 本标准规定了天然毛皮中动物源性成分定性分析的实时荧光ＰＣＲ 检测方法。 本标准适用于八种天然毛皮（水貂、兔、貉子、浣熊、马、牛、山羊和绵羊）的源性成分定性检测。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ／Ｔ１９４９５．２　转基因产品检测　实验室技术要求 ＧＢ／Ｔ２１１０２—２００７　动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法　实时荧光ＰＣＲ 方法 ＧＢ／Ｔ２５１６５—２０１０　明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法　实时荧光ＰＣＲ 法 ３　术语和定义、缩略语 ３．１　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 ３．１．１ 实时荧光聚合酶链式反应　狉犲犪犾狋犻犿犲狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀 在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，实时监控整个ＰＣＲ 进程，并通过扩 增曲线对未知模板进行定性分析的方法。 注：改写ＧＢ／Ｔ１９４９５．４—２０１８ ，定义３．１．２。 ３．１．２ 犆狋值　犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 ［ＧＢ／Ｔ１９４９５．４—２０１８ ，定义３．１．５］ ３．２　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ＤＮＡ：脱氧核糖核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ） ＤＴＴ：二硫苏糖醇（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ） ｄＮＴＰｓ：脱氧核苷三磷酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ） ＦＡＭ：６羧基荧光素（６ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ） Ｎａ２ＥＤＴＡ：乙二胺四乙酸钠盐（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄｄｉｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ） ＰＣＲ：聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ） ＳＤＳ：十二烷基硫酸钠（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ） １ 犌犅／犜３８４２１—２０１９ ＴＡＭＲＡ：６羧基四甲基若丹明（６ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ） 犜犪狇酶：ＤＮＡ 聚合酶（犜犪狇ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ） Ｔｒｉｓ：三羟甲基氨基甲烷［（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ］ １８ＳｒＲＮＡ：真核生物核糖体小亚基１８Ｓ基因（１８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ） ４　原理 提取动物毛皮试样中的ＤＮＡ，针对水貂、兔、貉子、浣熊、马、牛、山羊、绵羊物种特异性的内源基因 序列设计引物，通过特异性引物和标记荧光物质探针，对动物源性的ＤＮＡ 进行实时荧光ＰＣＲ 扩增，根 据ＰＣＲ 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实现对毛皮中动物源性成分的定性分析。 ５　试剂和材料 ５．１　一般规定：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２ 中一级水的规定。 ５．２　灭菌水。 ５．３　氢氧化钠（ＮａＯＨ）。 ５．４　三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）。 ５．５　盐酸（ＨＣｌ）。 ５．６　乙二胺四乙酸钠盐（Ｎａ２ＥＤＴＡ）。