ICS65.020.01DB33B 05浙 江省地方标准DB33/T 963—2015厚皮甜瓜种子纯度分子标记鉴定方法Purity identification of Musk melon variety using molecular marker analysis2015-05-07发布2015-06-07实施浙江省质量技术监督局发布 DB33/T 963—2015前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由浙江省农业厅提出。本标准由浙江省种植业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：宁波市农业科学研究院、宁波市种植业管理总站。本标准主要起草人：宋慧、王毓洪、张香琴、臧全宇、陆惠斌、张庆、范雪莲。I DB33/T 963—2015厚皮甜瓜种子纯度分子标记鉴定方法1范围本标准规定了厚皮甜瓜种子纯度分子检测方法的术语与定义、原理、试剂、仪器设备、操作步骤和样品纯度判定与计算。本标准适用于厚皮甜瓜种子纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。农业部1485号公告-4-2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化3术语与定义下列术语和定义适用于本标准。3.1品种纯度品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示[GB/T 3543.5-1995，定义3.2]。3.2杂株某差异位点杂交失败，该位点纯合的单株。3.33.43.5杂种一代某差异位点杂交成功，该位点杂合的单株。显性标记位点仅能检测显性等位基因，不能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记位点。共显性标记位点1 DB33/T 963—2015同时能检测出显性和隐性等位基因，能够区分纯合和杂合基因型的遗传标记位点。3.6随机扩增多态性DNA标记（RAPD）以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列（通常为10个碱基对）为引物，在热稳定的TaqDNA聚合酶作用下，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。3.7简单重复序列标记（SSR）根据真核生物中广泛存在的简单重复序列两端的互补保守区域设计引物。由于核心序列串联重复数目不同，PCR扩增后获得的产物长度不同，通过高分辨率琼脂糖凝胶电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。4原理从厚皮甜瓜幼苗新叶中提取基因组DNA，利用分子标记进行PCR扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶的分子筛效应和电泳分离的电荷效应作用下进行分离。通过溴化乙锭（EB）染色，在紫外光下发出荧光显示核酸谱带差异。不同厚皮甜瓜品种由于遗传组成不同，引物结合后扩增产物不同，出现扩增产物有和无、或者扩增片段大小不同的差异。这些差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对种子纯度进行鉴定。5试剂除非另有说明，仅使用分析纯试剂和去离子水。5.1引物5.1.1RAPDRAPD（ Random Amplified Polymorphic DNA）引物名称、序列及差异片段大小见表1。表1RAPD引物名称、序列及差异片段大小名称序列（5’-3’）ACCTGGACACCCACATCGGTACACCGGAACCCGAACACGG差异片段大小（bp）RAPD-1RAPD-2RAPD-3RAPD-41200/14001200/13001500460/5505.1.2SSRSSR（Simple Sequence Repeat）引物名称、序列及差异片段大小见表2。2 DB33/T 963—2015表2SSR引物名称、序列及差异片段大小名称F-序列（5’-3’）R-序列（5’-3’）差异片段大小（bp）SSR-1SSR-2SSR-3CAAAGGGCTACAATAACCATCATAATCACCCTATCTC225/350/400/450120/130/140/550/600140/150/320/350CAGCTCTACAACAACATCTCTGAAGAGACTACCATCCCCAATCCAACTCGACCAAGAAACTTTCCTTATGAGTTAGGGTTTC5.2琼脂糖5.2.1RAPD使用2%普通标准凝胶琼脂糖（DNA片段分离范围500 bp～20000 bp）。5.2.2SSR使用2.5%高分辨率标准凝胶琼脂糖（DNA片段分离范围40 bp～1000 bp）。5.310 g/L溴化乙锭溶液称取1.0g溴化乙锭（EB），溶于100mL水中。配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5.410 mol/L氢氧化钠溶液称取80.0 g氢氧化钠（NaOH），先用160 mL水溶解后，再加水定容到200 mL。5.50.5 mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH 8.0）称取18.6 g乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入70 mL水中，再加入2 g氢氧化钠，加热至完全溶解后，冷却至室温，用按本标准 5.4配置氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.61 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800 mL水中，加入42 mL盐酸，搅拌均匀。用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000 mL。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.7TE缓冲液（pH 8.0）分别量取10mL按本标准5.6配置的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液和2mL按本标准5.5配置的乙二胺四乙酸二钠溶液，加水定容至1000 mL。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.85×TBE缓冲液称取54 g三羟甲基氨基甲烷，27.5 g硼酸，先用500 mL水加热搅拌溶解后，加入20 mL按本标准5.5配置的乙二胺四乙酸二钠溶液，加水定容至1000 mL。使用时用水稀释成0.5×TBE。5.9加样缓冲液称取1 g水溶性钠型溴酚蓝于100 mL水中，涡旋直到完全溶解，配制成0.15%溴酚蓝。称取1 g二甲基苯腈蓝于足量水中，定容到100mL，配制成0.15%二甲基苯腈蓝。分别取1.5mL的0.