ICS65.020.20B31DB32备案号：37035-2013江 苏省地方 标 准DB32/T 2258-2012‘苏粉13号’番茄种子纯度 SRAP分子标记鉴定方法 Rules for identification purity of tomato sufen No13 using SRAP molecular markers 2012-12-28发布 2013-02-28实施发布江苏省质量技术监督局 DB32/T 2258-2012前言‘苏粉13号’番茄是江苏省农科院蔬菜所最新育成的高抗番茄黄化曲叶病毒病的杂种一代。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：赵丽萍、赵统敏、余文贵、杨玛丽。 DB32/T 2258-2012‘苏粉13号’番茄种子纯度SRAP分子标记鉴定方法1范围本标准规定了‘苏粉13号’及其亲本的品种纯度SRAP分子标记鉴定方法。本标准适用于‘苏粉13号’及其亲本的品种纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2-1995农作物种子检验规程扦样GB/T 3543.5-1995农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB 16715.3瓜菜作物种子茄果类3术语、定义和缩略词下列术语和定义适用于本标准。3.1SRAPsequence-related amplified polymorphism即相关序列扩增多态性，又叫基于序列扩增多态性，是基于PCR的标记系统。该标记通过17个碱基的正向引物和18个碱基的反向引物对开放读码框(oRFs)进行扩增。3.2品种纯度品种在DNA 分子标记条带方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检测样品种子数的百分率表示。3.3引物结合在模板DNA 上的互补短链，提供3＇-OH 末端作为DNA 合成的起点，延伸合成模板DNA 的互补链。3.4内含子真核生物细胞 DNA 中的间隔序列即为内含子，是存在于真核生物基因中无编码意义而被切除的序列。3.5启动子是一段位于结构基因5＇端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合1 DB32/T 2258-2012并具有转录起始的特异性。3.6缩略词下列缩略词适用于本标准。SRAP相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism)PCR 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction)DNA 脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid)TBE 三羟基氨基甲烷-硼酸一乙二胺四乙酸二钠（Tris Boric-acid EDTA)4原理SRAP标记均匀分布于番茄基因组中，该标记的正反引物分别是针对序列相对保守的编码区与变异大的内含子、启动子和间隔序列，而由于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大，从而扩增出SRAP多态性标记。不同番茄品种由于遗传结构的差异，经过一对或多对引物进行PCR扩增后会形成不同分子量大小的扩增产物，经染色形成不同番茄品种的电泳图谱，鉴定番茄品种纯度。5仪器设备及试剂5.1仪器设备PCR 扩增仪；电泳槽；电泳仪；电子天平（感量0.01g，0.001g）；冰箱；微量加样器（10μl，100μl，200μl，1000μl）；恒温水浴锅（0℃-100℃），高速冷冻离心机；磁力搅拌器；高压灭菌锅；数码照相机等。烧杯；容量瓶（500ml，1000ml）；离心管（0.2ml，0.5ml，1.5ml，2ml）；吸头(10μl，200μl，1000μl)；注射器（100ml）；96 孔PCR 板；离心管架；染色盒等。5.2试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；氢氧化钠(NaOH)；2+10 倍PCR 缓冲液（不含Mg ）；液氮；三氯甲烷；异戊醇；氯化镁（MgCl2）；四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）；TaqDNA 聚合酶（5U/μl）；SRAP 引物；矿物油；溴酚蓝；蔗糖；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；硼酸；无水乙醇；四甲基乙二胺；过硫酸铵；硫代硫酸钠；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液等。各种试剂配制见附录A 。6引物筛选适宜引物应为扩增后的苏粉13号番茄SRAP电泳条带含有双亲条带，而且带型清晰、重复性好。取苏粉13号种子5粒及父母本种子各2粒，利用一系列引物进行分析，从中确定适宜的引物。7方法步骤7.1样品制备从供检样品中随机取苏粉13号番茄种子200粒，播于穴盘中，待种子长出真叶时，随机选100株取叶片提取DNA。7.2DNA 提取取幼嫩叶片放入1.5ml离心管中；加液氮，用事先准备好的枪头进行捣碎研磨；然后迅速加入500μl提取液，并在涡旋仪上涡旋混匀；放入水浴锅，30min左右，每隔5min上下颠倒摇匀；之后加入跟提取液等体积的氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀，再静置3min左右；离心10min，12000r/min；提取上清液（枪头孔要剪大）再加冰冻过的等体积异丙醇，出现白色絮状沉淀；再冰冻10-30min，再离心，之后倒掉上2 DB32/T 2258-2012清液，底部即是DNA，用75%的乙醇洗涤2次，吹干，加入200μl灭菌ddH2O。样品DNA 溶液可以直接进行PCR 扩增或在-20℃下保存。7.3扩增SRAP-PCR(10μl)反应体系：l x Buffer，引物各0.3μmol· L-1，dNTPs0.2mmol·L-1，3.0mmol·L-1，o.6U Taq DNA polymerase，20ng模板 DNA。Mg2+PCR扩增反应程序：94℃ 3 min；94℃ 1 min，35℃ l min，72℃1.5min，5个循环；94℃ l min，50℃ l min，72℃ l.5 min，33个循环；72℃ 7 min延伸；扩增产物在4℃保存。7.4检测7.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶制作将玻璃板洗净，晾干后装玻璃板于胶条上，取 30% Arc:Bis1