中华人民共和国国家标准 GB5009.204—2014 食品安全国家标准 食品中丙烯酰胺的测定 2014-12-01发布 2015-05-01实施  GB5009.204—2014 前言 本标准代替 GB/T 5009.204－2005《食品中丙烯酰胺含量的测定方法气相色谱一质谱（GC-MS）法》。 本标准与GB/T 5009.204－2005相比，主要变化如下： ——增加第一法稳定性同位素稀释的液相色谱-质谱/质谱法； ——气相色谱-质谱法将外标法改为稳定性同位素稀释法。 I  GB5009.204—2014 食品安全国家标准 食品中丙烯酰胺的测定 1 范围 本标准规定了食品中丙烯酰胺的测定方法。 本标准适用于热加工（如煎、炙烤、焙烤等）食品中丙烯酰胺的测定。 第一法 稳定性同位素稀释的液相色谱-质谱/质谱法 2 原理 本标准应用稳定性同位素稀释技术，在试样中加入 C3标记的丙烯酰胺内标溶液，以水为提取溶剂， 13 经过固相萃取柱或基质固相分散萃取净化后，以液相色谱-质谱/质谱的多反应离子监测(MRM)或选择反 应监测(SRM)进行检测，内标法定量。 3 试剂和材料 注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 3.1 试剂 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 甲酸(HCOOH)：色谱纯。 甲醇(CH3OH)：色谱纯。 正己烷(n-C6H14)：分析纯，重蒸后使用。 乙酸乙酯(CH3COOC2H5)：分析纯，重蒸后使用。 无水硫酸钠(Na2SO4)：400℃，烘烤4 h。 硫酸铵[(NH4)2SO4]。 硅藻土：ExtrelutTM 20或相当产品。 3.2 标准品 3.2.1 3.2.2 丙烯酰胺(CH2=CHCONH2)标准品（纯度>99%）。 13C3-丙烯酰胺（13CH2=13CH13CONH2）标准品（纯度>98%）。 3.3 标准溶液的配制 3.3.1丙烯酰胺标准溶液的配制 3.3.1.1 丙烯酰胺标准储备溶液（1000 mg/L）：准确称取丙烯酰胺标准品，用甲醇溶解并定容，使丙 烯酰胺浓度为 1000 mg/L，置﹣20℃冰箱中保存。 3.3.1.2 丙烯酰胺中间溶液（100 mg/L）：移取丙烯酰胺标准储备溶液 1 mL，加甲醇稀释至 10 mL，使 丙烯酰胺浓度为 100 mg/L，置﹣20℃冰箱中保存。 3.3.1.3 丙烯酰胺工作溶液Ⅰ（10mg/L）：移取丙烯酰胺中间溶液 1mL，用 0.1%甲酸溶液稀释至 1  GB5009.204—2014 10 mL，使丙烯酰胺浓度为 10 mg/L。临用时配制。 丙烯酰胺工作溶液Ⅱ（1mg/L）：移取丙烯酰胺工作溶液Ⅰ1mL，用0.1%甲酸溶液稀释至 10 mL,，使丙烯酰胺浓度为 1 mg/L。临用时配制。 3.3.1.4 3.3.2 13 C3-丙烯酰胺内标溶液 3.3.2.1 13C3-丙烯酰胺内标储备溶液（1000mg/L）：准确称取 13C3-丙烯酰胺标准品，用甲醇溶解并 定容，使 13C3-丙烯酰胺浓度为 1 000 mg/L，置﹣20℃冰箱保存。 内标工作溶液（10 mg/L）：移取内标储备溶液1 mL，用甲醇稀释至 100 mL，使13C3-丙烯酰 胺浓度为 10 mg/L，置﹣20℃冰箱保存。 3.3.2.2 3.3.3 标准曲线工作溶液 取 6个10 mL容量瓶，分别移取0.1 mL、0.5 mL、1 mL丙烯酰胺工作溶液II（1 mg/L）和 0.5 mL、 1 mL和3 mL丙烯酰胺工作溶液I（10 mg/L）与内标工作溶液（10 mg/L）0.1 mL，用 0.1%甲酸溶液稀 释至刻度。标准系列溶液中丙烯酰胺的浓度分别为 10 μg/L、50μg/L、100 μg/L、500μg/L、1000 μg/L、3000 μg/L，内标浓度为 100 μg/L。临用时配制。 4 仪器和设备 4.1 4.2 液相色谱-质谱/质谱联用仪（LC-MS/MS）。 HLB固相萃取柱：6 mL、200 mg，或相当产品。 4.3 Bond Elut-Accucat固相萃取柱：3 mL、200 mg，或相当产品。 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 组织粉碎机。 旋转蒸发仪。 氮气浓缩器。 振荡器。 玻璃层析柱：柱长 30 cm，柱内径 1.8 cm。 涡旋混合器。 4.10超纯水装置。 4.11分析天平：感量为 0.1 mg。 4.12离心机：转速≤10000 r/m。 5 分析步骤 试样制备 5.1 5.1.1 样品提取 取 50 g试样，经粉碎机粉碎，﹣20℃冷冻保存。准确称取试样1 g～2 g（精确到 0.001 g），加入10 mg/L 13C3-丙烯酰胺内标工作溶液 10 μL（或 20 μL），相当于 100 ng（或 200 ng）的13C3-丙烯酰胺内标， 再加入超纯水 10 mL，振摇 30 min后，于4000 r/m离心10 min，取上清液待净化。 5.1.2 样品净化 注：任选下列一种方法进行净化。 5.1.2.1 基质固相分散萃取方法（选择 1）：在试样提取的上清液中加入硫酸铵 15 g，振荡 10 min，使 其充分溶解，于 4000 r/m离心10 min，取上清液 10 mL，备用。如上清液不足 10 mL，则用饱和硫酸铵 补足。取洁净玻璃层析柱，在底部填少许玻璃棉并压紧，依次填装 10 g无水硫酸钠、2g硅藻土。称取 5 g硅藻土 ExtrelutTM 20与上述试样上清液搅拌均匀后，装入层析柱中。用70 mL正己烷淋洗，控制流 2  GB5009.204—2014 速为 2 mL/min，弃去正己烷淋洗液。用 70 mL乙酸乙酯洗脱丙烯酰胺，控制流速为2 mL/min，收集乙 酸乙酯洗脱溶液，并在 45℃水浴中减压旋转蒸发至近干，用乙酸乙酯洗涤蒸发瓶残渣三次（每次1 mL）， 并将其转移至已加入 1 mL 0.1%甲酸溶液的试管中，涡旋振荡。在氮气流下吹去上层有机相后，加入 1 mL 正己烷，涡旋振荡，于 3500 r/m离心5 min，取下层水相经 0.22 μm水相滤膜过滤，待LC-MS/MS测定。 5.1.2.2 固相萃取柱净化（选择 2）：在试样提取的上清液中加入 5 mL正己烷，振荡萃取10 min，于 10000 r/m离心5 min，除去有机