ICS67050
CCS C.53
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T54396—2022
.
出口食品中食源性致病菌快速检测方法
PCR-试纸条法 第6部分空肠弯曲菌
:
RapiddetectionoffoodbornepathogensfromexportedfoodbyPCR-Lateralflow
distickmethod—Part6Campylobacterjejuni
p:
2022-03-14发布2022-10-01实施
中华人民共和国海关总署发 布SN/T5439.6—2022
前言
本文件按照标准化工作导则第 部分 标准化文件的结构和起草规则的规定
GB/T1.1—2020《1:》
起草。
本文件是 的第部分 已经发布了以下部分
SN/T5439 6。SN/T5439:
第 部分 沙门氏菌
——— 1: ;
第 部分 金黄色葡萄球菌
——— 2: ;
第 部分 副溶血性弧菌
——— 3: ;
第 部分 克罗诺杆菌
——— 4:;
第 部分 产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌
——— 5: O157;
第 部分 空肠弯曲菌
——— 6:;
第 部分 单核细胞增生李斯特氏菌
——— 7:。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位 中华人民共和国南京海关 中华人民共和国上海海关 南京农业大学 苏州蝌蚪生
:、
物技术有限公司 广东省科学院微生物研究所广东环凯生物科技有限公司 杭州傲敏生物科技有限
、
公司。
本文件主要起草人申进玲 赵丽娜周琬 薛峰 蒋原 曾德新王涓 薛亮 蔡芷荷杨捷琳苏静
: 、
陆寿祥曾静
、 。
ⅠSN/T5439.6—2022
出口食品中食源性致病菌快速检测方法
PCR-试纸条法第6部分 空肠弯曲菌
:
1 范围
本文件规定了出口食品中食源性致病菌 空肠弯曲菌快速检测的试纸条方法
-PCR-。
本文件适用于出口食品中空肠弯曲菌的定性检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中 注日期的引用文。,
件 仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本 包括所有的修改单适用于
, ; ,( )
本文件。
食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲菌检验
GB478 9.9—2014
分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 6682
实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
GB/T27403—2008
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
空肠弯曲菌 Campylobacterjejuni
其是一种微需氧的革兰氏阴性菌呈逗点状或 形 无芽孢在含 或和
,S ,。5% O2 10% CO2 85% N2
的环境中生长最好在正常大气或无氧环境中均不能生长 属于弯曲菌属 是一种常见的病原菌
,。 , 。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
脱氧核糖核酸
DNA: (deoxyribonuleicacid)
脱氧核苷酸三磷酸
dNTP: (deox yribonuleosidetrip hosphate)
乙二胺四乙酸
EDTA: (ethylene diaminetetraaceticacid)
异硫氰酸盐
FITC: (fluorescein5-isothiocyanate)
三羟甲基氨基甲烷
Tris:[tris(hydroxymethyl)aminomethane]
5 方法原理
对样品中空肠弯曲菌进行增菌培养后提取 采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐
DNA,
标记的空肠弯曲菌的特异性检测引物进行 扩增检测用试纸条上含有金标记的抗异硫氰酸盐的
PCR。
抗体 可与 产物上的异硫氰酸盐标记分子结合在检测线位置上有抗地高辛抗体 可与 产物
, PCR, ,PCR
上的地高辛标记分子结合 从而显色 如模板未扩增 则无 产物与地高辛抗体及抗体结合
, 。 ,PCR FITC,
从而不能在检测线 线 位置显示颜色
(T ) 。
1SN/T5439.6—2022
6 试剂和材料
除另有规定外 试剂为分析纯或生化试剂 实验用水符合 的要求
, GB/T6682 。
61 引物
.
空肠弯曲菌扩增引物详见表靶基因序列参见附录
1, A。
表1 试验用引物
致病菌种类 引物序列端标记物 靶基因片段长度
(5;→3;)5’
地高辛
’
空肠弯曲菌 ACAACTTGGTGACGATGTTGTA-3 lpxA
异硫氰酸盐330bp
CAATCATGAGCAATATGACAATAAGCCAT-3’
62 试剂
.
621提取液
.. DNA:20mmoL/LTris-HCl,2mmol/LEDTA,1.2% TritonX-100(pH8.0)。
622 预混液
.. 2×PCR 。
623 引物
.. PCR 。
624试纸条通过采购的原料试剂自行组装 参见附录 或采用等效的商品化试纸条
..: ( B), 。
62 5 展 开 液 体 积 分 数以 及 浓 度 为 的
..:10 mmol/L Tris、1% BSA、1% ( )Tween20 0.05 mol/L
或采用等效的商品化产品
NaOH; 。
7 仪器设备
71 离心机离心力g
. :≥ 12000 。
72 微量移液器
. :100μL~1000μL,20μL~200μL,0.5μL~10μL。
73 仪
. PCR。
74 恒温水浴锅
. :100 ℃±1 ℃。
75 天平 感量
. : 0.01g。
76 计
. pH。
77 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计
.。
8 检验步骤
81 样品制备和增菌
.
按照 的方法进行样品制备和增菌
GB4789.9—2014 。
82 样品 DNA 提取
.
821增菌液模板 DNA 的制备
..
对于 获得的增菌液 采用如下方法制备模板
7.1 , DNA:
2