ICS67050
CCS C.53
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T54394—2022
.
出口食品中食源性致病菌快速检测方法
PCR-试纸条法 第4部分 克罗诺杆菌
:
RapiddetectionoffoodbornepathogensfromexportedfoodbyPCR-Lateralflow
distickmethod—Part4Cronobacter
p:
2022-03-14发布2022-10-01实施
中华人民共和国海关总署发 布SN/T5439.4—2022
前言
本文件按照标准化工作导则第 部分 标准化文件的结构和起草规则的规定
GB/T1.1—2020《1:》
起草。
本文件是 的第部分 已经发布了以下部分
SN/T5439 4。SN/T5439:
第 部分 沙门氏菌
——— 1: ;
第 部分 金黄色葡萄球菌
——— 2: ;
第 部分 副溶血性弧菌
——— 3: ;
第 部分 克罗诺杆菌
——— 4:;
第 部分 产志贺毒素大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌
——— 5: O157;
第 部分 空肠弯曲菌
——— 6:;
第 部分 单核细胞增生李斯特氏菌
——— 7:。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位 中华人民共和国南京海关 中华人民共和国上海海关 南京农业大学 合肥工业大
:、
学 苏州蝌蚪生物技术有限公司 广东省科学院微生物研究所 广东环凯生物科技有限公司 杭州傲敏生

物科技有限公司。
本文件主要 起 草 人 袁 辰 刚 孙 欣 薛 峰 蒋 原 曾 海 燕 蔡 淑 珍 曲 晓 莹 申 进 玲 陈 伟 曾 德 新
: 、、、
戴建君苏静 陆寿祥曾静
、 。
ⅠSN/T5439.4—2022
出口食品中食源性致病菌快速检测方法
PCR-试纸条法 第4部分克罗诺杆菌
:
1 范围
本文件规定了出口食品中食源性致病菌 克罗诺杆菌快速检测的试纸条方法
-PCR-。
本文件适用于出口食品中克罗诺杆菌的定性检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中 注日期的引用文。,
件 仅该日期对应的版本适用于本文件 不注日期的引用文件其最新版本 包括所有的修改单适用于
, ; ,()
本文件。
食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属 阪崎肠杆菌 检验
GB478 9.40—2016 ()
分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 6682
实验室质量控制规范食品分子生物学检测
GB/T27403—2008
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
克罗诺杆菌Cronobacter
其为革兰氏阴性无芽孢杆菌 具有周生鞭毛 有动力 兼性厌氧大多数产黄毒素 具有葡萄糖苷
, 、 , , ,α-
酶活性 是一种常见的病原菌
, 。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
脱氧核糖核酸
DNA: (deoxyribonuleicacid)
脱氧核苷酸三磷酸
dNTP: (deox yribonuleosidetrip hosphate)
乙二胺四乙酸
EDTA: (ethylene diaminetetraaceticacid)
异硫氰酸盐
FITC:(fluorescein5-isothiocyanate)
三羟甲基氨基甲烷
Tris:[tris(hydroxymethyl)aminomethane]
5 方法原理
对样品中克罗诺杆菌进行增菌培养后提取 采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐
DNA,
标记的克罗诺杆菌的特异性检测引物进行 扩增检测用试纸条上含有金标记的抗异硫氰酸盐的
PCR 。
抗体 可与 产物上的异硫氰酸盐标记分子结合 在检测线位置上有抗地高辛抗体可与 产物
,PCR, ,PCR
上的地高辛标记分子结合 从而显色 如模板未扩增 则无 产物与地高辛抗体及抗体结合
, 。 ,PCR FITC,
从而不能在检测线线 位置显示颜色
(T ) 。
1SN/T5439.4—2022
6 试剂和材料
除另有规定外 试剂为分析纯或生化试剂 实验用水符合 的要求
, GB/T6682 。
61 引物
.
克罗诺杆菌扩增引物详见表靶基因序列参见附录
1, A。
表1 试验用引物
致病菌种类 引物序列端标记物 靶基因 片段长度
(5;→3;)5’
地高辛
ITS-lA
克罗诺杆菌 F:5’-CAGGAGTTGAAGAGGTTTAACT-3’
异硫氰酸盐ITS-G &ITS-lA 250bp
R:5’-GTGCTGCGAGTTTGAGAGACTC-3’
62 试剂
.
621 提取液
.. DNA :20mmoL/LTris-HCl,2mmol/LEDTA,1.2% TritonX-100(pH8.0)。
622 预混液
.. 2×PCR 。
623 引物
.. PCR 。
624试纸条通过采购的原料试剂自行组装 参见附录 或采用等效的商品化试纸条
..: ( B), 。
62 5 展 开 液 体 积 分 数以 及 浓 度 为 的
.. :10 mmol/L Tris、1% BSA、1% ( )Tween20 0.05 mol/L
或采用等效的商品化产品
NaOH; 。
7 仪器设备
71 离心机 离心力 g
. : ≥ 12000 。
72 微量移液器
. :100μL~1000μL,20μL~200μL,0.5μL~10μL。
73 仪
. PCR 。
74 恒温水浴锅
. :100 ℃±1 ℃。
75 天平 感量
. :0.01g。
76 计
. pH 。
77 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计
. 。
8 检验步骤
81 样品制备和增菌
.
按照 的方法进行样品制备和增菌
GB4789.40—2016 。
82 样品 DNA 提取
.
821增菌液模板DNA 的制备
..
对于获得的增菌液 采用如下方法制备模板
8.1 , DN A:
吸取 菌液加入 离心管中 离心 弃上清
a) 1 mL 1.5mL,12000g 3 min, ;
加入 无菌生理盐水 完全溶解沉淀 离心 弃上清
b) 1mL0.85%, ,12000g 3min, ;
2SN/T5439.4—2022
加入 提取液混匀后沸水浴 置冰上冷却
c) 10 0μLDN A 10mi n,;
离心 上清液即为模板
d) 12000g 2min,DNA。
也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸。
822可疑菌落模板 DNA 的制备
..
对于 分离到的可疑菌落 可直接挑取可疑菌落再按照步骤制备模板 以待检测
8.1 , 8.2.1c) DNA。
也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒并按其说明提取核酸。
83 DNA 浓度和纯度的测定
.
取溶液 加 双 蒸 水 稀 释 至 使 用 核 酸 蛋 白 分 析 仪 或 紫 外 分 光 光 度 计 分 别 检 测
5μLD NA1 mL,
和 处的吸光值 和 的浓度按公式 计算
260 280
260nm280nm AA 。DNA(1) :
c A N
= × ×50/1000 …(1 )
式中
:
c浓度 单位为纳克每微升
———DNA ,(ng/μL);
A 处的吸光值
———260nm ;
N核酸稀释倍数
——— 。
当比值在 之间时适宜于 扩增
A260/A280 1.7~1.9 , PCR。
84 PCR 扩增
.
841PCR 反应体系
..
见表
2。
表2 PCR 反应体系
组分总体积
(25μL)
预混液
2×PCR 12.5μL
上游引物
(10μmol/L) 0.25μL
下游引物
(10μmol/L) 0.25μL
模板a
DNA5μL
无菌水
7μL
a模板的浓度限定在 之间
DNA 10pg/μL~10ng/μL 。
842反应条件
..
预变性变 性退 火延 伸个 循 环 后 进 入
95 ℃ 5 min;95 ℃30s,58 ℃30s,72 ℃1 min,35 72 ℃,
保存
7min;4 ℃。
检测过程中分别设阳性对照 阴性对照和空白对照 用克罗诺杆菌 模板作阳性对照 用非克
、 。 DNA,
罗诺杆菌 模板作阴性对照 用等体积的无菌水代替模板 作空白对照
DNA, DNA 。
843试纸条检测
..
取产 物 加 入 上 样 稀 释 液 混 匀 后 垂 直 缓 慢 滴 加 于 试 条 样 品 垫 中 观 察
6μLPCR , 54μL , ,3 min
结果。
3