ICS 11.220 ICS 11.220 DB22 吉 林省地 方标准 DB 22/T 3111—2020 猫杯状病毒检测 实时荧光 RT-PCR法 Detection method of real time quantitative RT-PCR for Feline calicivirus 2020-03-16发布 2020-03-30实施 吉林省市场监督管理厅发布 本标准仅供内部使用 本标准仅供内部使用 印 本标准仅供内部使用 不得翻 印 前言 前言 牛江婷。 DB22/T 3111—2020 本标准仅供内部使用 本标准仅供内部使用 印 本标准仅供内部使用 不得翻 印 DB22/T 3111—2020 猫杯状病毒检测 实时荧光RT-PCR法 范围 本标准规定了猫杯状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的试剂和材料、仪器设备、样品、试验步骤、结 果判定和废弃物处理的技术要求。 本标准适用于猫杯状病毒核酸的检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct循环阈值 （Cycle threshold） Cdna 互补脱氧核糖核酸 （Complementary Deoxyribonucleic acid） DMEM改良Eagle培养基 （Dulbecco's modification of Eagle's medium） ORF开放阅读框 （Open Reading Frame） RNA核糖核酸 （Ribonucleic acid） RT-PCR 反转录聚合酶链式反应 （Reverse transcription polymerase chain reaction） 原理 根据猫杯状病毒衣壳蛋白ORF2的保守区基因序列，设计引物和探针。探针在5’端标记FAM荧光素作 为报告荧光基团，3’端标记Eclipse作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的 基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；反应 进入延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来， 所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式 增长，荧光信号也相应增长。每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越 多，Ct值越小。 5 试剂和材料 5.1 试剂 引物和探针名称 引物和探针名称 浓度 μmol/L 上游引物 F CTGACTTCAAATTTCATCTC 0.20 下游引物 R TGGGAATTAAGTCAGAGG 0.20 探针 (FAM) ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC (Eclipse) 0.40 DB22/T 3111—2020 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 5.1.1 DMEM培养液。 液氮。 RNA提取试剂盒。 反转录试剂盒。 阳性对照，为猫杯状病毒的细胞培养物或非感染性体外转录RNA。 阴性对照，为不含猫杯状病毒的细胞培养液。 无 RNA酶的水（Rnase free water）。 Taq酶。 材料 无菌拭子。 离心管，1.5 mL、15 mL和 50 mL。 吸头，200 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、2 μL～20 μL和 0.5 μL～10 μL。 5.2.4 无 RNA酶吸头，200 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、2 μL～20 μL和0.5 μL～10 μL。 5.2.5 无RNA酶离心管，0.2 mL和1.5 mL。 5.2.6 研钵。 5.2.7 荧光定量 PCR反应管, 根据荧光 PCR仪要求选择单管、八连排管或 96孔荧光反应板。