ICS 65.020.20 B 16 DB32 江苏省地方标准 DB32/T 3680—2019 玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法 The detection of pathogen for Maize Rough Dwarf disease by dot immuobinding assay method 2019 - 12 - 03发布 2019 - 12 - 25实施 江苏省市场监督管理局 发布 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：周彤、杜琳琳、周益军、孙枫、兰莹、李硕、范永坚。 玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法 1 范围 本标准规定了大麦、小麦、玉米植株和灰飞虱携带玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法。 本标准适用于大麦、小麦、玉米植株和灰飞虱携带玉米粗缩病病原的检测。 2 斑点酶联免疫吸附检测原理 硝酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。将抗原吸 附于硝酸纤维素膜后，可利用膜作为固相载体进行抗原抗体反应。当加入抗原的特异性抗体后，即可与 膜上的抗原结合，然后再加入带有标记物的二抗，使酶标记通过二抗和相应抗体的结合间接地交联于纤 维素膜上。最后加入标记物相应的底物后，标记物即可与底物作用形成不溶性产物，呈现斑点状着色。 3 仪器设备与试剂材料 3.1 仪器设备 台式离心机（5 000 r/min）；具盖塑料离心管：200 μL；培养皿（直径为90 mm）；塑料盒（规格 为100 mm×50 mm）。 3.2 试剂材料 3.2.1 试验用水均为蒸馏水，使用的化学试剂未作说明均为分析纯级别。 3.2.2 包被缓冲液：0.05 mol/L，pH值9.6。称取 1.59 g Na2CO3和2.93 g NaHCO3，加水定容至1 000 mL， 用HCl调pH值至9.6，4℃保存。 3.2.3 磷酸盐Tween 20缓冲液（0.01M PBST）：0.01mol/L，pH=7.5。称取40 g NaCl, 1 g KCl, 1 g KH2PO4 和15 g Na2HPO4，加水定容至5 000 mL，用HCl调节pH值至7.5，再加入2.5 mLTween 20，4℃保存。 3.2.4 磷酸盐缓冲液（0.02M PBS）：0.02 mol/L，pH值7.5。称取40 g NaCl，1 g KCl，1 g KH2PO4，15 g Na2HPO4，加水定容至2 500 mL，4℃保存。 3.2.5 1%脱脂奶粉封闭液：1 g脱脂奶粉加入100 mL磷酸盐Tween20缓冲液中，4℃保存。 3.2.6 辣根过氧化物酶固体显色底物溶液：6 mg的4-氯-1-萘酚加入2 mL无水乙醇中，4℃保存备用，使 用时加入10 mL 磷酸盐缓冲液中，再加入10 μL H2O2。 3.2.7 BCIP/NBT显色底物：碱性磷酸酶底物显色试剂盒。 3.2.8 单克隆抗体（单抗）：玉米粗缩病病原RBSDV单克隆抗体，效价为1:5 000～1:10 000，－20℃保 存。 3.2.9 酶标二抗：Goat Anti-Mouse IgG Antibody，HRP（检测灰飞虱），Goat Anti-Mouse IgG Antibody, AP（检测植物），－20℃保存。 4 植物样品检测 4.1 样品制备 4.1.1 田间采集新鲜的大麦、小麦、玉米植株的茎秆或叶片，装至无菌样品袋中。标记样品编号、取样 时间、取样地点，48 h内送至实验室，放置-20℃冰箱保存备用，避免反复冻融。 4.1.2 取0.5 mg大麦、小麦或玉米的茎秆或叶片研磨成粉末，碳酸盐包被液稀释100倍，离心（5 000 r/min） 3 min，取上清液备用。 4.2 封闭 4.2.1 预先用铅笔将硝酸纤维素膜（NC膜）划成5 mm×5 mm的正方格，取2.0 μL 4.1获得的上清液点于 NC膜上正方格中心（以不超出正方格一半为准）；同时取2.0 μL已采用本方法测定为感染玉米粗缩病 的玉米汁液点于膜上预先标记好的正方格内，作为阳性对照，取2.0 μL已采用本方法测定为不感染玉米 粗缩