ICS 65.020.30 B 41DB43 湖南省地方标准 DB43/T 1671—2019 动物疫病病毒核酸提取磁珠法 Extraction of Animal Disease Virus Nucleic Acid Magnetic-Bead-Based Method2019-10-15发布 2019-12-15实施湖南省市场监督管理局发布 DB43/T 1671—2019 目次前言……………………………………………………………………………………………………… Ⅱ 1 范围…………………………………………………………………………………………………… 1 2 规范性引用文件……………………………………………………………………………………… 1 3 术语和定义…………………………………………………………………………………………… 1 4 主要仪器设备………………………………………………………………………………………… 1 5 主要耗材与器械……………………………………………………………………………………… 1 6 主要试剂……………………………………………………………………………………………… 1 7 样品与样品预处理…………………………………………………………………………………… 1 8 核酸提取……………………………………………………………………………………………… 2 9 生物安全要求………………………………………………………………………………………… 2DB43/T 1671—2019 前言本标准按照 GB/ 1.1—2009给出的规则起草。本标准某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省畜牧水产局提出。本标准由湖南省农业农村厅归口。本标准起草单位：湖南省动物疫病预防控制中心，长沙市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：何世成、王昌建、陈智、林源、唐小明、谭丹、范叶、王卫国、彭志、朱春霞、汪洪冰。DB43/T 1671—2019 动物疫病病毒核酸提取磁珠法 1 范围本标准规定了磁珠法提取动物疫病病毒核酸的技术要求。本标准适用于我省动物疫病诊断、监测中的 PCR检测。 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡所注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 3.1 磁珠法在核酸提取过程中，使用胍盐等去垢剂裂解细胞、释放核酸，用磁珠在高盐、低 pH的条件下特异性吸附核酸，在低盐、高 pH条件下解离核酸，实现核酸提取的方法。 4 主要仪器设备核酸提取仪；台式 1.5 mL离心机；微量可调移液器[（1～10）μL、（10～100）μL、（20～200） μL、（100～1 000）μL等规格]；组织研磨仪或其它研磨设备；冰箱；生物安全柜；高压灭菌锅。 5 主要耗材与器械与移液器匹配的各规格吸头； 1.5 mL或 2 mL离心管；96孔深孔板；磁套。 6 主要试剂包括裂解液、洗涤液、洗脱液、蛋白酶 K溶液、磁珠悬液等，或等效的磁珠法商品化试剂盒。 7 样品及样品预处理 7.1 样品类型DB43/T 1671—2019 血清、抗凝血、脏器组织、O-P液、拭子样品、精液、细胞培养液等样品，样品的采集、保存与运输按照 NY/T 541的规定执行。 7.2 样品预处理不同样品类型处理方法如下： a）血清、抗凝血、拭子样品、O-P液、精液、细胞培养液等液体性样品无需进行预处理，直接用于核酸提取。 b）组织样品：取 1g左右组织，剪碎，进行研磨匀浆，8 000 r/m离心 1 min，上清液用于核酸提取。 8 核酸提取 8.1根据核酸提取仪的操作程序，设置 96孔深孔板的功能布局，包括 1列裂解孔、1列磁珠孔、2列洗涤孔、1列洗脱孔。 8.2在裂解孔中加入 500 μL裂解液、20 μL蛋白酶 K、200 μL样品，磁珠孔中加入 600 μL磁珠稀释液、25 μL磁珠悬液，洗涤孔中加入 700 μL洗涤液，洗脱孔中加入 100 μL洗脱液。 8.3将深孔板放入核酸提取仪内，安装好磁套。 8.4运行核酸提取程序：90 ℃混匀裂解 15 min；转移磁珠孔中的磁珠至裂解孔，释放磁珠，混匀，再磁吸 90 s；转移磁珠至第一个洗涤孔，释放磁珠，加热至 85 ℃混匀洗涤 2 min，磁吸 90 s；转移磁珠至第二个洗涤孔，释放磁珠，加热至 85 ℃混匀，磁吸 30 s；转移磁珠至洗脱孔，释放磁珠，加热至 85 ℃混匀洗脱，洗脱时间 5 min，磁吸 90 s；转移磁珠至磁珠孔，释放磁珠。 8.5程序运行结束后，洗脱孔中的溶液为提取获得的病毒核酸溶液，可立即用于实验检测，也可冷冻保存备用。以上操作也可按等效的磁珠法商品化试剂盒要求进行。 9 生物安全要求提取结束后，磁套、96孔板等应使用自封口袋进行密闭封存，提取过程及废弃物处理应遵守 GB 19489、NY/T 1948等生物安全管理的相关要求。