ICS11.020WS中华人民共和国卫生行业标准C 62WS/T571—2017裂头绦虫幼虫检测Detection of diphyllobothroid larvae2017-08-01发布2018-02-01实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 发布WS/T 571—2017前言本标准依据GB/T 1.1－2009给出的规则起草本标准起草单位：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所上海出入境检验检疫局上海市疾病预防控制中心本标准起草人：陈韶红李树清张小萍许学年卢艳蔡玉春张永年李浩艾琳郑彬IWS/T 571—2017裂头绦虫幼虫检测1范围本标准规定了裂头绦虫幼虫检测的操作流程本标准适用于各级疾病预防控制机构医疗机构和食品检测机构对鱼蛙和蛇中裂头绦虫幼虫的检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T 18088出入境动物检疫采样标准GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1裂头蚴plerocercoid larvae裂头绦虫的幼虫是假叶目（Pseudophyllidea）裂头科（Diphyllobothriidae）绦虫第三期幼虫的总称（参见附录A）3.2阔节裂头蚴plerocercoid larvae of Dibothriocephalus latus或phyllobothrium latum寄生在鱼体内阔节裂头绦虫的第三期幼虫3.3曼氏裂头蚴plerocercoid larvae of Spirometra mansoni寄生在蛙蛇或人体内曼氏迭宫绦虫的第三期幼虫4仪器器材1WS/T 571—20174.14.24.34.44.54.64.74.8生物显微镜体视显微镜PCR扩增仪电泳仪凝胶成像系统超净工作台高速离心机解剖用手术器械5试剂材料5.1试剂胃蛋白酶消化液；Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）；琼脂糖凝胶；6×加样缓冲液；1002000bp DNAmarker；灭菌双蒸馏水(ddH2O)；70%乙醇（配制见附录B的B.1）5.2引物扩增裂头蚴核糖体DNA转录间隔区（ITS）引物序列；扩增裂头蚴细胞色素C氧化酶（Cox1）引物序列；阔节裂头蚴特异性引物序列及曼氏裂头蚴特异性引物序列（见附录B的B.2）5.3阳性对照阳性对照为裂头绦虫相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴裂头绦虫全基因组DNA6检测步骤6.1样品准备6.1.16.1.2样品种类：海鱼淡水鱼蛙和蛇样品采集：采样按照 GB/T 18088执行6.2样品检测6.2.1压片检查法2WS/T 571—2017用手术剪对受检的鱼蛙和蛇逐条/只进行解剖取出内脏将腹腔壁内膜刮下观察腹腔内壁表面若有可疑白色点状物用手术剪或手术刀分离皮肉用两把小镊子将肌肉撕开取含有白色点状物的组织用载玻片压片用生物显微镜镜检判定结果6.2.2蛋白酶消化法称取样品250 g并剪成小块按样品与胃蛋白酶消化液1:5的比例加入消化液37℃消化至无肉眼可见的肉组织为止消化后用0.8mm×0.8mm（10目）网筛过滤滤液置于尖底量筒内加水（用水参照GB/T 66828）至最大刻度处沉淀洗涤至水清全部沉渣置平皿用体视显微镜镜检判定结果6.2.3核酸检测法取样6.2.3.1在体视显微镜下挑取虫体初步鉴定后备用PCR反应设立阳性对照对照为裂头绦虫相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴裂头绦虫全基因组DNA无菌水作空白对照6.2.3.26.2.3.3DNA的提取（见附录B的B.3）反应体系总体积为 25 ?L,模板 DNA 2 ?L上下游引物（10 ?mol/L）各 0.5 ?LdNTPs 2 ?LMgCl2 2.5 ?L10×Buffer 2.5 ?LTaq酶 (5 U/μL) 0.2 ?L补充 ddH2O至25 ?L6.2.3.4PCR反应程序94℃预变性3 min；94℃变性30s55℃退火30 s72℃延伸1min35个循环；72℃延伸7 min6.2.3.5电泳取10?L产物与2