中华人民共和国国家标准GB4789.42—2016食品安全国家标准食品微生物学检验 诺如病毒检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局发布GB4789.42—2016前言本标准代替SNT1635/—2005《贝类中诺沃克病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法》本标准与SN/T1635—2005相比,主要变化如下 :———标准名称修改为 “食品安全国家标准———标准检测范围从 “贝类”扩增为“食品”;———修改“操作步骤”;食品微生物学检验诺如病毒检验”;———增加“质量控制要求”,可参见附录 C;———删除“普通RT-PCR方法”ⅠGB4789.42—2016食品安全国家标准食品微生物学检验 诺如病毒检验范围1本标准规定了食品中诺如病毒 (Norovirus)的实时荧光 RT-PCR检测方法本标准适用于贝类 ,生食蔬菜,胡萝卜瓜坚果等硬质表面食品,草莓西红柿葡萄等软质水果等食品中诺如病毒核酸的检测 设备和材料2除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下 :2.1实时荧光PCR仪冷冻离心机无菌刀片或等效均质器 涡旋仪2.22.32.42.52.62.72.82.92.102.11天平:感量为0.1g振荡器水浴锅离心机高压灭菌锅低温冰箱:-80℃微量移液器2.12 pH计或精密pH试纸网状过滤袋:400mL无菌棉拭子无菌贝类剥刀 橡胶垫2.132.142.152.162.172.182.19无菌剪刀无菌钳子无菌培养皿2.20无RNase玻璃容器:见E.1.22.21无RNase离心管无RNase移液器吸嘴无RNase药匙无RNasePCR薄壁管:见E.1.3试剂3除有特殊说明外 ,所有实验用试剂均为分析纯 ;实验用水均为无 RNase超纯水:见E.2.13.1 GⅠGⅡ基因型诺如病毒的引物 探针:见过程控制病毒的引物 探针:见A.1A.13.21GB4789.42—2016过程控制病毒 :制备见附录 C3.33.4外加扩增控制 RNA:制备见附录 D3.5 Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGBE)缓冲液:见E.2.23.6 5×PEG/NaCl溶液(500gL/聚乙二醇PEG80001.5molLNaCl,/ ):见E.2.3磷酸盐缓冲液(PBS):见E.2.4氯仿/正丁醇的混合液 :见E.2.53.73.83.9蛋白酶K溶液:见E.2.63.10 75%乙醇:见E.2.73.11 Trizol试剂:见E.2.8检验程序4诺如病毒检验程序见图 1图 1诺如病毒检验程序操作步骤病毒提取55.1注:样品处理一般应在 4℃以下的环境中进行运输实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检测应将样品保存在 -80℃冰箱中,试验前解冻 样品处理和 PCR反应应在单独的工作区域或房间进行每个样品可设置2~3个平行处理 软质水果和生食蔬菜5.1.15.1.1.1将25g软质水果或生食蔬菜切成约2.5cm×2.5cm×2.5cm的小块(如水果或蔬菜小于该体积,可不切)将样品小块移至带有 400mL网状过滤袋的样品袋 ,加入40mLTGBE溶液(软质水果样品,5.1.1.22GB4789.42—2016需加入30UA.niger果胶酶,或1140UA.aculeatus果胶酶),加入10μL过程控制病毒5.1.1.3室温,60次/min,振荡20min酸性软质水果需在振荡过程中,每隔10min检测pH,如pH低于9.0时,使用 / 至 ,每调整一次pH,延长振荡时间 10min1molLNaOH调pH9.55.1.1.4将振荡液转移至离心管,如体积较大,可使用2根离心管10000rmin4℃/ ,,离