中华人民共和国国家标准GB 5413.10—2010食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 K1的测定 National food safety standard Determination of vitamin K1 in foods for infants and young children, milk and milk products 2010-03-26发布2010-06-01实施中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发布 GB5413.10—2010前言本标准等同采用国际分析家学会（AOAC）AOAC999.15VitaminKin MilkandInfantFormulasLiquid Chromatographic Method。本标准代替GB/T 5413.10-1997《婴幼儿配方食品和乳粉维生素K1的测定》。本标准与GB/T 5413.10-1997相比，主要变化如下：——标准名称改为《婴幼儿食品和乳品中维生素K1的测定》；——试样处理改为“试样经酶水解后，用NaOH皂化，用正己烷萃取”；——测定改为用高效液相色谱柱后还原荧光法定量测定维生素 K1；——仪器中将“高压液相色谱仪带紫外检测器”修改为“高效液相色谱仪，带荧光检测器”。本标准附录 A、附录 B和附录C均为资料性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB 5413-1985、GB/T 5413.10-1997。I? GB5413.10—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素 K1的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素 K1的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素 K1的测定。2规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3原理用脂肪酶降解试样中的脂肪和不饱和脂肪酸，对于含淀粉试样需先用淀粉酶降解试样中的淀粉，经碱皂化后，用正己烷提取维生素 K1。通过液相色谱法分离，柱后还原维生素 K1，荧光检测器检测，外标法定量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682规定的一级水。4.14.24.34.44.54.64.74.84.94.104.11氢氧化钠溶液（10 mol/L）：临用前配制。95 %乙醇。饱和氯化钠溶液。正己烷：色谱纯。无水硫酸钠。甲醇：色谱纯。二氯甲烷：色谱纯。冰醋酸。氯化锌。无水乙酸钠。流动相：甲醇（4.6）900 mL，二氯甲烷（4.7）100mL，冰醋酸（4.8）0.3mL，氯化锌（4.9）1.5 g，无水乙酸钠（4.10）0.5 g，溶解后用 0.45 μm滤膜过滤。4.12淀粉酶：酶活力≥1.5 U/mg。1 GB5413.10—20104.13脂肪酶：酶活力≥700 U/mg。4.14锌粉：粒度 50 μm～70 μm。4.15维生素 K1标准溶液：标准溶液浓度校正方法参见附录A。4.15.1维生素 K1标准贮备液（2mg/mL）：称取 0.05 g维生素K1标准品（精确到 0.1 mg），于 25 mL容量瓶中，用正己烷溶解定容。4.15.2维生素 K1标准中间液（20μg/mL）：取标准贮备液（4.15.1）1 mL加正己烷定容至100 mL。5仪器和设备5.15.25.35.45.55.65.7高效液相色谱仪，带有荧光检测器。天平：感量为 0.1 mg。分液漏斗：250 mL。旋转蒸发器。恒温空气浴振荡器。离心机：转速≥3000转/分钟。氮吹仪。6分析步骤6.1试样处理6.1.1含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约 2.5 g或液体试样约10 g（精确到 0.1 mg）于三角瓶中，加入 0.5 g淀粉酶（4.12），用 30 mL温水溶解。6.1.2不含淀粉的试样称取混合均匀的固体试样约2.5 g或液体试样约10g（精确到0.1 mg）于三角瓶中，用30mL温水溶解。6.2测定液的制备向上述处理过的试样溶液中加入 1 g脂肪酶（4.13），于37℃±5℃恒温空气浴振荡器中振荡过夜，使其充分酶解。取出酶解好的试样，加入 2 mL氢氧化钠溶液（4.1），用 50 mL乙醇（4.2）将溶液转入 250 mL的分液漏斗中，充分混匀（必要时加少量饱和氯化钠溶液（4.3））。加入50 mL正己烷（4.4）。充分振摇 2 min，静置分层。放出下层水相于另一个 250 mL分液漏斗中，留下有机相。向水相中再次加入 50 mL正己烷再次萃取。合并有机相。用适量蒸馏水洗有机相两次。将有机相通过无水硫酸钠（4.5）脱水过滤到一个 500 mL的烧瓶中，在旋转蒸发器上于40℃±2℃下蒸发至近干。用正己烷（4.4）转移残留物到一个 10 mL试管中，置氮吹仪上于40℃ ±2℃下吹干，准确加入1mL正己烷（4.4），充分振荡溶解残留物。将试管放入冰箱中在 0℃以下冷冻1 h备用。6.3测定6.3.1色谱参考条件2 GB5413.10—2010色谱柱：C18色谱柱，150mm ×4.6 mm，5 μm，或具同等性能的色谱柱；锌还原柱：4.6 mm ×50 mm（参见附录 B）；检测波长： 激发波长为 243 nm，发射波长为 430 nm；流动相：甲醇（4.6）900 mL，二氯甲烷（4.7）100 mL，冰醋酸（4.8）0.3 mL，氯化锌（4.9）1.5 g，无水乙酸钠（4.10）0.5 g，溶解后用 0.45 μm滤膜过滤；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。6.3.2维生素 K1标准曲线绘制分别准确吸取标准中间液（4.15.2）0.0 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL加正己烷定容至25 mL，此标准系列工作液维生素K1浓度分别为0.00 μg/mL，0.40 μg/mL，0.80 μg/mL，1.20 μg/mL，1.60 μg/mL，2.00 μg/mL。将系列标准维生素K1工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高，以峰面积或峰高