中华人民共和国国家标准GB28404—2012食品安全国家标准保健食品中α-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的测定2012-05-17发布2012-07-17实施中华人民共和国卫生部发布 GB 28404—2012食品安全国家标准保健食品中α-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的测定1范围本标准规定了保健食品中 α-亚麻酸、二十碳五烯酸（简称EPA，下同）、二十二碳五烯酸（简称DPA，下同）和二十二碳六烯酸（简称 DHA，下同）的气相色谱测定方法。本标准适用于保健品食品中 α-亚麻酸、EPA、DPA、DHA的测定，不适用于以脂肪酸乙酯为有效成分的保健食品中 α-亚麻酸、EPA、DPA、DHA的测定。2原理试样经酸水解后提取脂肪，其中 α-亚麻酸、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳五烯酸（DPA）、二十二碳六烯酸（DHA）经酯交换生成甲酯后，通过气相色谱分离检测，以保留时间定性，外标法定量。3试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T6682规定的一级水。3.1试剂3.1.13.1.23.1.33.1.43.1.53.1.63.1.73.1.8氢氧化钾（KOH）。盐酸（HCl）。无水乙醚（C2H5OC2H5）。乙醇（CH3CH2OH）：体积分数≥95％。石油醚：沸程 30℃～60℃。正己烷（CH3(CH2)4CH3）：色谱纯。甲醇（CH3OH）：色谱纯。无水硫酸钠（Na2SO4）。3.2试剂配制氢氧化钾甲醇溶液（0.5 mol/L）：称取2.8 g氢氧化钾，用甲醇溶解并定容至100 mL，混匀。3.3标准品3.3.13.3.23.3.33.3.4α-亚麻酸甲酯(C19H32O2)：纯度≥99.0％。EPA甲酯(C21H32O2)：纯度≥98.5％。DPA甲酯(C23H36O2)：纯度≥98.0％。DHA甲酯(C23H34O2)：纯度≥98.5％。3.4标准溶液的配制1 GB 28404—20123.4.1单个脂肪酸甲酯标准储备液(4.0 mg/mL)：称取 100.0 mg α-亚麻酸甲酯、EPA甲酯、DPA甲酯、DHA甲酯标准物质于25.0 mL容量瓶中，分别用正己烷溶解并定容至刻度，摇匀。此溶液应贮存于-18℃冰箱中。3.4.2脂肪酸甲酯混合标准中间液（1.0 mg/mL）：分别吸取脂肪酸甲酯标准储备液 2.50 mL于10.0 mL容量瓶中，摇匀，亦为标准曲线最高浓度，临用时配制。3.4.3脂肪酸甲酯标准工作液：分别吸取脂肪酸甲酯中间液 0.40 mL、0.80 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0mL于10.0 mL容量瓶中，用正己烷定容，此浓度即为0.040 mg/mL、0.080 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20mg/mL、0.40 mg/mL的标准工作液，临用时配制。4仪器与设备4.14.24.34.44.54.6气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器（FID）。天平：感量为 1 mg和0.1 mg。旋转蒸发仪。离心机：转速≥4000 r/min。涡旋混合器。恒温水浴锅。5分析步骤5.1试样制备5.1.1试样处理固体试样5.1.1.1称取已粉碎混合均匀的待测试样 0.5 g～2 g（精确到 0.001 g）（含待测组分约 5 mg/g～10 mg/g）加入 50 mL比色管中，加8 mL水，混匀后再加10 mL盐酸。将比色管放入70℃～80℃水浴中，每隔5 min～10 min以涡旋混合器混合一次，至试样水解完全为止，约需40 min～50 min。取出比色管，加入 10 mL乙醇，混合。冷却至室温后将混合物移入100 mL具塞量筒中，以25 mL无水乙醚分次洗比色管，一并倒入量筒中。密塞振摇 1 min。加入 25 mL石油醚，密塞振摇1 min，静置 30min，分层，将吸出的有机层过无水硫酸钠（约 5 g）滤入浓缩瓶中。再加入 25 mL无水乙醚密塞振摇1 min，25 mL石油醚，密塞振摇 1min，静置、分层，将吸出的有机层经过无水硫酸钠（约 5g）滤入浓缩瓶中，按“再加入 25 mL无水乙醚??，静置、分层、过无水硫酸钠”重复操作一次，将全部提取液用旋转蒸发仪于 45℃减压浓缩近干。用正己烷少量多次溶解浓缩物，转移至25mL容量瓶并定容，摇匀。按5.1.2步骤甲酯化处理。5.1.1.2油类制品称取混合均匀的油类制品 0.2 g～1 g（精确到 0.001 g）（含待测组分约 10 mg/g～20 mg/g。）至25mL容量瓶中，加入5 mL正己烷轻摇溶解，并用正己烷定容至刻度，摇匀。按5.1.2步骤甲酯化处理，脂肪酸乙酯型油类制品的物理鉴别参见附录 A。5.1.2甲酯化吸取待测液（5.1.1.1，5.1.1.2）2.0 mL至10 mL具塞刻度试管中，加入2.0 mL氢氧化钾甲醇溶液，立即移至涡旋混合器上振荡混合 5 min，静置 5 min，加入 6 mL蒸馏水，上下振摇0.5 min，静置分层后，吸取下层液体，弃去后再反复用少量蒸馏水进行洗涤，并用吸管弃去水层，直至洗至中性（若有2 GB 28404—2012机相有乳化现象，以 4000 r/min离心10 min），吸取正己烷层待上机测试用。注：如使用塑料离心管或塑料刻度试管进行试样处理须同步进行空白对照试验。5.2气相色谱参考条件5.2.1色谱柱:键合交联聚乙二醇固定相，柱长 30 m，内径 0.32 mm，膜厚 0.5 μm或同等性能的色谱柱。5.2.2柱温箱温度：起始温度 180℃，10℃/min升温至220℃，再以8℃/min升温至 250℃，保持13 min。5.2.35.2.45.2.55.2.6进样口温度：250℃；进样量1 μL，分流比 20∶1。FID检测器温度：270℃。载气：高纯氮气，流量 1.0 mL/min，尾吹 25 mL/min。氢气：40 mL/min；空气 450 mL/min。5.3标准曲线的制作将 1 μL的标准系列各浓度溶液（3.4.2、3.4.3），注入气相色谱仪中，测得相应的峰面积或峰高，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积或峰高为纵坐标，绘制标准曲线（标准溶液气相色谱图见附录 B中