中华人民共和国国家标准谷物和大豆中赭曲霉毒素AGB/T 13111-91的测定方法Method for determination of ochratoxin A in cereal and bean━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━1主题内容与适用范围本标准规定了谷物和大豆中赭曲霉毒素 A的薄层色谱测定方法。本标准适用于小麦、玉米和大豆中赭曲霉毒素 A的测定。在薄层板上赭曲霉毒素 A的最低检出量为4ng。本方法的最低检测量为 10 μg/kg。2原理用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取样品中的赭曲霉毒素 A，样品提取液经液-液分配后，根据其在 365 nm紫外光灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与标准比较测定含量。3试剂以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水。3.1石油醚(60～90℃或 30～60℃)。3.2甲醇。3.3三氯甲烷。3.4甲苯。3.5乙酸乙酯。3.8甲酸。3.7冰乙酸。3.8乙醚。3.9苯-乙腈(98：2)。3.10 0.1mol/L磷酸[c(H3PO4)=0.1mol/L]：称取11.5g磷酸(85%)加水稀释至1000mL。3.11 2mol/L盐酸溶液[c(HCL)=2mol/L]：量取20 mL盐酸，加水稀释至120 mL。3.12 4%氯化钠溶液。3.13 0.1mol/L碳酸氢钠溶液[c(NaHCO3)=0.1mol/L]：称取8.4g碳酸氢钠,加适量水溶解，并用水稀释至 1000 mL。3.14 硅胶 G：薄层层析用。3.15 赭曲霉毒素 A(以下简称 OA)标准溶液：用苯-冰乙酸(99：1)配成 40 μg/mL赭曲霉毒素 A贮备液，并用紫外分光光度计测定其浓度。浓度的测定参照 GB 5009.22《食品中黄曲霉毒素 B1的测定方法》中2.14条(赭曲霉毒素A的最大吸收峰波长333 nm，分子量 403，克分子消光系数值为 5550)。精密吸取贮备液，用苯稀释成每毫升含赭曲霉毒素A0.5μg，赭曲霉毒素 A标准液应置冰箱中避光保存。 4仪器所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡，用自来水，蒸馏水冲洗。4.1小型粉碎机。4.2电动振荡器。4.3玻璃板：5cm×20cm。4.4薄层涂布器。4.5展开槽：内长 25cm、宽 6cm、高 4cm。4.6紫外光灯：365 nm。4.7微量注射器：10μL、50μL。4.8具 0.2mL 尾管的10 mL，小浓缩瓶。5分析步骤5.1提取5.1.1甲法称取 20g粉碎并通过20目筛的样品，置于200mL具塞锥形瓶中，加入100mL三氯甲烷和 10mL 0.1mol/L磷酸，振荡30min后通过快速定性滤纸过滤；取20ml，滤液置于250mL分液漏斗中,加 50mL 0.1mol/L碳酸氢钠溶液振摇2min,静置分层后，将三氯甲烷层放入另一个 100mL分液漏斗中(少量乳化层，或即使三氯甲烷层全部乳化都可放入分液漏斗中)，加入 50mL 0.1mol/L碳酸氢钠溶液重复提取三氯甲烷层,静置分层后弃去三氯甲烷层(如三氯甲烷层仍乳化,弃去,不影响结果)。碳酸氢钠水层并入第一个分液漏斗中,加约 5.5mL2mol/L盐酸溶液调节 pH2～3(用 pH试纸测试)， 加入25mL三氯甲烷振摇 2min，静置分层后,放三氯甲烷层于另一盛有 100mL水的250mL分液漏斗中,酸水层再用10mL三氯甲烷振摇、提取、静置，将三氯甲烷层并入同一分液漏斗中。振摇、静置分层 ,用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷层于一 75ml 蒸发皿中，将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干。用约 8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解，转入具尾管的 10mL浓缩瓶中,置80℃水浴锅上用蒸汽加热吹氮气(N2),浓缩至干,加入 0.2mL苯-乙腈(98：2)溶解残渣,摇匀,供薄层色谱点样用。5.1.2乙法称取20g 粉碎并通过 20 目筛的样品加于 200mL 具塞锥形瓶中,加 30mL石油醚和100mL甲醇-水(55：45)，在瓶塞上抹上一层水盖严防漏。振荡 30min后，通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中，待下层甲醇水层分清后，取出 20mL滤液置于100mL分液漏斗中,用pH试纸测试,一般为 pH5～6。加入25mL 三氯甲烷振摇 2min，静置分层后放出三氯甲烷层于另一分液漏斗中，再用 10mL三氯甲烷重复振摇提取甲醇-水层(在用三氯甲烷振摇提取时，如发生乳化现象，可滴加甲醇促使其分层)，将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中，加入50～100mL 4%氯化钠溶液(加入量视品种不同而异，大豆加 100mL，小麦、玉米则加 50mL左右)，振摇放 置(如为大豆样品提取液还须轻轻反复倒转分液漏斗，使乳化层逐渐上升。如乳化严重可加入少许甲醇),待三氯甲烷层澄清后,用脱脂棉擦干分液漏斗下端,放三氯甲烷层于75mL蒸发皿中(如为大豆样品须再加入 10mL三氯甲烷振摇，三氯甲烷层合并于同一蒸发皿中)，将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干。以下操作自“用约 8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解”起，按甲法操作。5.2测定5.2.1薄层板的制备称取4g 硅胶 G,加约10mL 水于乳钵中研磨至糊状。立即倒入涂布器内制成5cm×20cm,厚度 0.3mm的薄层板三块,在空气中干燥后,在105～110℃活化 1h，取出放干燥器中保存。5.2.2点样取两块薄层板，在距薄层板下端 2.5cm的基线上用微量注射器滴加两个点：在距板左边缘 1.7cm处滴加OA标准溶液8μL(浓度 0.5μg/mL),在距板左边缘 2.5cm处滴加样液 25μL,然后在第二块板的样液点上加滴 OA 标准溶液 8μL(浓度0.5μg/mL)。点样时,需边滴加边用电吹风吹干，交替使用冷热风。5.2.3展开5.2.3.1展开剂横展剂：乙醚或乙醚-甲醇-水(94：5：1)。纵展剂：a.甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(6：3：1.2：0.06)或甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6：3：1.4)；b.苯-冰乙酸(9：1)。5.2.3.2展开横向展开：在展开槽内倒入