中华人民共和国国家标准蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定方法（荧光法和 2,4-二硝基苯肼法）GB/T 12392-90Method for determination of total ascorbic acid in fruits,vegetablesand derived products-Fluorometric method and colorimetric method━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━1主题内容与适用范围本标准规定了用荧光法和 2,4-二硝基苯肼比色法测定抗坏血酸。本标准适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。第—篇荧光法本标准参照采用国际标准 ISO 6557/1—1986《蔬菜、水果及其制品中抗坏血酸的测定方法》。2原理样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后,与邻苯二胺(OPDA)反应生成有荧光的喹喔啉(quinoxaline),其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比,以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与 OPDA反应,以此排除样品中荧光杂质产生的干扰,最小检出限 0.022μg/mL。3试剂本实验用水均为蒸馏水。3.1偏磷酸-乙酸液:称取 15g偏磷酸,加入40mL冰乙酸及250mL水,加温,搅拌,使之逐渐溶解,冷却后加水至 500mL。于 4℃冰箱可保存 7～l0d。3.20.l5mol/ L硫酸:取10mL硫酸,小心加入水中,再加水稀释至1200mL。3.3偏磷酸-乙酸-硫酸液:以 0.15mol/L硫酸液为稀释液,其余同3.1配制。50％乙酸钠溶液:称取 500g乙酸钠(CH3COONa·3H2O),加水至1OOOmL。3.43.5硼酸-乙酸钠溶液:称取 3g硼酸,溶于l00mL乙酸钠溶液(3.4)中。临用前配制。3.6邻苯二胺溶液:称取 20mg邻苯二胺,于临用前用水稀释至100mL。3.7抗坏血酸标准溶液(1mg/mL) (临用前配制)：准确称取 50mg抗坏血酸,用溶液(3.1)溶于 50mL容量瓶中,并稀释至刻度。3.8抗坏血酸标准使用液(l00μg/mL)：取 10mL抗坏血酸标准液,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至 100mL。定容前试 pH值,如其pH>2.2时,则应用溶液(3.3)稀释。3.90.04%百里酚蓝指示剂溶液:称取 0.1百里酚蓝,加0.02mol/L氢氧化钠溶液,在玻璃研钵中研磨至溶解,氢氧化钠的用量约为 10.75 mL,磨溶后用水稀释至250 mL。变色范围：pH值等于 1.2pH值等于 2.8红色黄色蓝色pH值大于 43.10 活性炭的活化：加 200g炭粉于1L1+9盐酸中,加热回流1～2h,过滤,用水洗至滤液中 无铁离子为止,置于 110～120 ℃烘箱中干燥,备用。4仪器和设备4.1实验室常用设备。4.2荧光分光光度计或具有 350 nm及430 nm波长的荧光计。4.3捣碎机。5操作方法5.1样品液的制备：称取 100g鲜样,加100g偏磷酸-乙酸溶液(3.1),倒入捣碎机内打成匀浆,用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色,即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释,若呈黄色或蓝色,则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释,使其 pH为1.2。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。当样品液含量在 40～100μg/mL之间,一般取 ZOg匀浆,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至 100mL,过滤,滤液备用。5.2测定步骤5.2.1氧化处理：分别取样品滤液(5.1)及标准使用液(3.8)各 100mL于 200mL带盖三角瓶中,加 2g活性炭,用力振摇1min,过滤,弃去最初数毫升滤液,分别收集其余全部滤液,即样品氧化液和标准氧化液,待测定。5.2.2各取 10mL标准氧化液于2个100 mL容量瓶中,分别标明“样准”及“样准空白”。5.2.3各取 10mL样品氧化液于2个100 mL容量瓶中,分别标明“样品”及“样品空白”。5.2.4于“标准空白”及“样品空白”溶液中各加 5mL硼酸-乙酸钠溶液,混合摇动15min,用水稀释至 100mL,在 4℃冰箱中放置 2～3h,取出备用。5.2.5于“样品”及“标准”溶液中各加入 5mL 50%乙酸钠液,用水稀释至 100mL,备用。5.3标准曲线的制备取上述“标准”溶液(5.2)(抗坏血酸含量 10μg/mL)0.5、1.0、1.5和2.OmL标准系列,取双份分别置于 10mL带盖试管中,再用水补充至2.0mL。荧光反应按5.4。5.4荧光反应取(5.2.4)中“标准空白”溶液,“样品空白”溶液及(5.2.5)中“样品”溶液各 2mL,分别置于 10mL 带盖试管中。在暗室迅速向各管中加入 5mL 邻苯二胺溶液,振摇混合,在室温? ? ? ? ? ?35min,? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?338nm? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?420nm? ? ? ? ? ? ?强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标,对应的抗坏血酸含量为横坐标,绘制标准曲线或进行相关计算,其直线回归方程供计算时使用。6计算c·V100X=━━━━━×F×━━━━.........................(1)m1000式中：X──样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量,mg/100g；c──由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度,μg/mL；m─—试样质量,g；F─—样品溶液的稀释倍数；V──荧光反应所用试样体积,mL。 7结果的允许差同一实验室平行或重复测定结果相对偏差绝对值≤10%。第二篇2,4-二硝基苯肼比色法8原理总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸,样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸,再与 2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎,根据脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比,进行比色定量。9试剂本实验用水均为蒸馏水。试剂纯度均为分析纯。9.14.5mol/L硫酸:谨慎地加250mL硫酸(比重1.84)于 700mL水中,冷却后用水稀释至1000mL。9.29.385%硫酸：谨慎地加