文本描述
版权所有·禁止翻制、电子发售 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 犛犖／犜２９６５ —２０１１ 植 物 病 原 真 菌 分 子 生 物 学 检 测 规 范 犆狉犻狋犲狉犻狅狀 狅狀 犱犲狋犲犮狋犻狅狀 狅犳狆犾犪狀狋狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犳狌狀犵犻 犫狔 犿狅犾犲犮狌犾犪狉 犫犻狅犾狅犵狔 ２０１１０５３１ 发 布 ２０１１１２０１ 实 施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布 版权所有·禁止翻制、电子发售 犛犖／犜２９６５ —２０１１ 前 言 本 标 准 按 照 ＧＢ／Ｔ１．１—２００９ 给 出 的 规 则 起 草 。 本 标 准 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出并 归 口。 本 标 准 起 草 单 位 ：中 华 人 民 共 和 国 珠 海 出入 境 检 验 检 疫 局 、华 南 农 业 大 学 、深 圳 职 业 技 术 学 院。 本 标 准 主 要 起 草 人 ：彭 仁 、曾 大 兴 、习平 根 、李 敏 慧 、姜 子 德 、张 卫 东 、乐 海 洋 、陈 德 蓉 、冯欣。 Ⅰ 版权所有·禁止翻制、电子发售 犛犖／犜２９６５ —２０１１ 植 物 病 原 真 菌 分 子 生 物 学 检 测 规 范 １ 范 围 本 标 准 规 定 了 植 物 病 原 真 菌 分 子 生 物 学 检 测规 范。 本 标 准 适 用 于 植 物 及 其 产 品 中 的 植 物 病 原 真菌 、分 离 纯 化 的 植 物 病 原 真 菌 的 分 子 生 物 学 检 测。 ２ 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 注 日 期的 版 本 适 用 于 本 文 件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ，其 最 新 版 本 （包括 所 有 的 修 改 单 ）适 用 于 本 文 件。 ＧＢ／Ｔ１９４９５ ．２ 转 基 因 产品 检 测 实 验 室 技 术 要 求 ＧＢ／Ｔ２３６３２ 进 境 植 物 检 疫 截 获 有 害 生 物 鉴 定 复 核 规 程 ＧＢ／Ｔ２７４０３ 实 验 室 质 量 控 制 规 范 食 品 分 子 生 物 学 检 测 ＳＮ／Ｔ１１２７ 小 麦 印 度 腥 黑 穗 病 菌 检 疫 鉴 定 方 法 ＳＮ／Ｔ１１５５ 玉 米 霜 霉 病 菌 检 疫 鉴 定 方 法 ＳＮ／Ｔ１１９３ 基 因 检 验 实 验 室 技 术 要 求 ＳＮ／Ｔ２０８０ 栎 树 猝 死 病 菌 检 疫 鉴 定 方 法 ＳＮ／Ｔ２１２６ 黑 麦 草 腥 黑 穗 病 菌 检 疫 鉴 定 方 法 ３ 术 语 、定 义 和 缩 略 语 ３．１ 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。 ３．１．１ 样 品 狊犪犿狆犾犲 取 自 某 一 整 体 的 一 个 或 多 个 部 分 ，旨 在 提供 该 整 体 的 相 关 信 息 ，通 常 作 为 判 断 该 整 体 的 基 础。 ３．１．２ 聚 合 酶 链 式 反 应 狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀；犘犆犚 体 外 酶 促 合 成 特 异 ＤＮＡ 片 段 的 一 种 分 子 生 物 学 实 验 方 法 ，主 要 由 高温 变 性 、低 温 退 火 和 适 温 延 伸 三 个 步 骤 反 复 的 热 循 环 构 成 ：即 模 板ＤＮ Ａ 先 经 高 温 变 性 为 单 链 ，在ＤＮ Ａ 聚 合 酶 和 适 宜 的 温 度 下 ，两条 引 物 分 别 与 两 条 模 板 ＤＮＡ 链 上 的 一 段 互 补 序 列 发 生 退 火 ，接 着 在ＤＮ Ａ 聚 合 酶 的 催 化 下 以 四 种 脱 氧 核 苷 酸 三 磷 酸 （ｄＮＴＰｓ）为 底 物 ，使 退 火 引 物 得 以 延伸 。 如 此 反 复 ，使 位 于 两 段 已 知 序 列 之 间 的ＤＮ Ａ 片 段 呈 几 何 倍 数 扩 增。 ３．１．３ 巢 式 聚 合 酶 链 式 反 应 狀犲狊狋犲犱 犘犆犚 ；狀犘犆犚 巢 式 ＰＣＲ 利 用 两 套 ＰＣＲ引 物 对 （巢 式 引 物 ）进行 两 轮 ＰＣＲ扩 增 反 应 的 一 种 分 子 生 物 学 实 验 技 术 。 在 这 种 技 术 中 ，首 先 用 一 对 外 引 物 进 行 第 一 轮ＰＣＲ扩 增 ，然 后 再 使 用 第 一对 引 物 扩 增 的 ＤＮＡ 序 列 内 部 的 一 对 内 引 物 再 次 扩 增 ，所 以 称 为 巢 式ＰＣＲ 。 由 于 使 用 了两 对 引 物 并 且 进 行 了 两 轮 扩 增反 应 ，因 此 实 验 的 敏 １ 版权所有·禁止翻制、电子发售 犛犖／犜２９６５ —２０１１ 感 性 和 特 异 性 均 有 所 增 强。 ３．１．４ 多 重 聚 合 酶 链 式 反 应 犿狌犾狋犻狆犾犲狓 犘犆犚 多 重 ＰＣＲ 在 同 一 反 应 体 系 里 加 上 两 对 以 上 引 物 ，同时 扩 增 出 多 个 核 酸 片 段 的 ＰＣＲ反 应 ，其 反 应 原 理 ，反 应 试 剂 和 操 作 过 程 与 一 般 ＰＣＲ相 同。 ３．１．５ 实 时 荧 光 犘犆犚 狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀狋犘犆犚 利 用 荧 光 信 号 伴 随 着 ＰＣＲ产 物 的 增 加 而 增 强 的 原 理 ，在 ＰＣＲ 扩 增 过 程 中 ，连续 不 断 地 检 测 反 应 体 系 中 荧 光 信 号 的 变 化 ，根 据 荧 光 信 号 基 线 的 平 均 值 和 平 均 标 准 差 ，得 出 大 于 平 均 值 的 荧 光 值 即 阈值 ，收 集 荧 光 信 号 增 强 到 预 定 阈 值 时 的 ＰＣＲ循 环 次 数 ，即 Ｃｔ 值 。 根 据 Ｃｔ 值 判 断 样 品 是 否 带 有 目 标 病 原 真 菌。 ３．１．６ 目 标 犇犖犃阴 性 对 照 狀犲犵犪狋犻狏犲 犇犖犃 狋犪狉犵犲狋犮狅狀狋
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