文本描述
中华人民共和国国家标准 犌犅１５１９３．６—２０１４ 食品安全国家标准 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 ２０１５０１２８发布 ２０１５０５０１实施 中华 人民共和 国 国家卫生和计划生育委员会 发布 犌犅１５１９３．６—２０１４ 前言 本标准代替ＧＢ１５１９３．６—２００３《哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验》。 本标准与ＧＢ１５１９３．６—２００３相比，主要变化如下： ———标准名称修改为“食品安全国家标准 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验”； ———修改了范围； ———增加了术语和定义； ———修改了试验目的和原理 ； ———修改了试验方法； ———修改了数据处理。 Ⅰ 犌犅１５１９３．６—２０１４ 食品安全国家标准 哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 １ 范围 本标准规定了哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验的基本试验方法和技术要求。 本标准适用于评价受试物对哺乳动物骨髓细胞的遗传毒性。 ２ 术语和定义 ２．１ 染色体结构畸变 通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂中期的染色体结构变化。如染色体中间缺失和 断片，染色体互换和内交换等 。结构畸变可分为染色体型畸变 （ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｔｙｐｅａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）和染色单 体型畸变（ｃｈｒｏｍａｔｉｄｔｙｐｅａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）。 ２．２ 染色体型畸变 染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。 ２．３ 染色单体型畸变 染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。 ２．４ 染色体数目畸变 染色体数目发生改变 ，不同于正常核型。 ２．５ 核内复制 在ＤＮＡ复制的Ｓ期之后，细胞核未进行有丝分裂就开始了另一个Ｓ期的过程。其结果是染色体 有４８１６、、…倍的染色单体。 ２．６ 裂隙 染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的最小错误排列 。 ２．７ 有丝分裂指数 中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值 。 ３ 试验目的和原理 在试验动物给予受试物后 ，用中期分裂相阻断剂 （如秋水仙素或秋水仙胺 ）处理，抑制细胞分裂时纺 锤体的形成，以便增加中期分裂相细胞的比例 ，随后取材、制片、染色、分析染色体畸变。 本试验可检测受试物能否引起整体动物骨髓细胞染色体畸变，以评价受试物致突变的可能性 。若 １ 犌犅１５１９３．６—２０１４ 有证据表明受试物或其代谢产物不能到达骨髓 ，则不适用于本方法。 ４ 仪器和试剂 ４．１ 仪器 实验室常用设备、恒温水浴锅（３７℃±５℃）、离心机、生物显微镜。 ４．２ 试剂 ４．２．１ 秋水仙素（／）：置于棕色瓶中，冰箱保存。 ０．４ｍｇｍＬ ４．２．２ 氯化钾溶液（０．０７５ｍｏｌＬ ／）。 ４．２．３ 固定液：甲醇与冰醋酸以 混合，临用时现配。 ３∶１ ４．２．４ 姬姆萨（Ｇｉｅｍｓａ）储备染液：取Ｇｉｅｍｓａ染料３．８ｇ和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，逐渐加入甲醇 至３７５ｍＬ，待完全溶解后，再加入１２５ｍＬ甘油，混合均匀。置３７℃恒温箱中保温４８ｈ。保温期间振 摇数次，促使染料的充分溶解 。取出过滤，室温保存，两周后使用。 ４．２．５ Ｇｉｅｍｓａ应用染液：取１份Ｇｉｅｍｓａ储备染液与９份磷酸盐缓冲液（／１１５ｍｏｌＬ／）混合而成。临用 时配制。 ４．２．６ 磷酸盐缓冲液（ｐＨ６．８）。 ４．２．６．１ 磷酸氢二钠溶液（／ ／）：磷酸氢二钠（ＮａＨＰＯ２４）９．４７ｇ溶于１０００ｍＬ去离子水中。 ４．２．６．２ 磷酸二氢钾溶液（／ ／）：磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）９．０７ｇ溶于１０００ｍＬ去离子水中。 ４．２．６．３ 取磷酸氢二钠溶液（／１１５ｍｏｌＬ／）５０ｍＬ与磷酸二氢钾溶液（／１１５ｍｏｌＬ５０ｍＬ／）混合。 ４．２．７ 阳性对照物：常用环磷酰胺，丝裂霉素等。 １１５ｍｏｌＬ １１５ｍｏｌＬ Ｃ ５ 试验方法 ５．１ 受试物 受试物应使用原始样品 ，若不能使用原始样品 ，应按照受试物处理原则对受试物进行适当处理 。 ５．２ 实验动物 ５．２．１ 动物选择 常用健康年轻的成年大鼠或小鼠 ，如使用小鼠，可选择７周龄～１２周龄，试验开始时动物体重的差 异不应超过平均体重的 ２０％。动物应随机分组，每组雌性和雄性动物至少各 ５只。如果试验设有几个 采样时间点，则要求每组每个性别每个采样时间点都有 ５只能用于分析的动物 。 ５．２．２ 动物准备 试验前动物在实验动物房至少应进行 ３ｄ～５ｄ环境适应和检疫观察 。 ５．２．３ 动物饲养 实验动物饲养条件应符合 ＧＢ１４９２５、饮用水应符合ＧＢ５７４９、饲料应符合ＧＢ１４９２４的有关规定。 试验期间动物自由饮水和摄食 ，每笼动物数应满足实验动物最低需要的空间 ，以不影响动物自由活动和 观察动物的体征为宜 。 ２ 犌犅１５１９３．６—２０１４ ５．３ 剂量 应进行预试验以选择最高剂量 。如果受试物具有毒性 ，应设３个剂量，最高剂量组原则上为动物出 现严重中毒表现和（或）个别动物出现死亡的剂量 ，一般可取１２ＬＤ／５０，低剂量组应不表现出毒性 ，分别 取／ 和／ 作为中、低剂量。对于在低或无毒剂量下具有特异生物学活性的物质（如激素 １４ＬＤ １８ＬＤ ５０ ５０ 和丝裂源）可以抑制骨髓细胞有丝分裂指数 （５０％以上）为指标确定最高剂量 ，按等比级数２向下设置 中、低剂量组。急性毒性试验给予受试物最大剂量 （最大使用浓度和最大灌胃容量 ）动物无死亡而求不 出ＬＤ５０，并且根据结构相关物质资料不能推断受试物具有遗传毒性时，则不必设３个剂量。按以下顺 序只设一个剂量： ａ） １０ｇｋｇ／ 体重； ｂ）人的可能摄入量的１００倍； ）一次最大灌胃剂量，连续染毒１４ｄ。另设溶媒对照组和阳性对照组，如果没有文献资料或历史 ｃ 性资料证实所用溶媒不具有有害作用或致突变作用，还应设空白对照组 。阳性对照物可用丝 裂霉素Ｃ（１．５ｍｇｋｇ／ 体重～２．０ｍｇｋｇ ／ 体重）或环磷酰胺（４０ｍｇｋｇ／体重）经口或腹腔注射 给予。 ５．４ 试验步骤 ５．４．１ 给予受试物方式 经口给予受试物，受试物溶液一次灌胃量不应超过 ２０ｍＬｋｇ／ 体重。采用一次染毒或多次染毒方 式。一次染毒应分两次采集标本 ，即每组动物分两个亚组 ，亚组１于染毒后１２ｈ～１８ｈ处死动物采集 第一次标本，亚组２于亚组１动物处死后２４ｈ采集第二次标本。如果采用多次染毒方式 ，可给予受试 物２次～４次，每次间隔２４ｈ，在末次染毒后１２ｈ～１８ｈ采集
==>> 点击下载文档