ICS 65.020.01 B 16 DB32 江苏省地方标准 DB32/T 3681—2019 小麦产毒镰刀菌种群分子分型技术 规范 Technical specification for molecular typing of toxin-producing fusarium species in wheat 2019 - 12 - 03发布 2019 - 12 - 25实施 江苏省市场监督管理局 发布 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：邢宇俊、仇剑波、董飞、徐剑宏、史建荣、吴季荣、陆丹丹。 小麦产毒镰刀菌种群分子分型技术规范 1 范围 本标准规定了小麦产毒镰刀菌种群以及产毒素化学型区分中镰刀菌DNA的提取、PCR扩增、电泳 检测及结果判定方法和操作规范。 本标准适用于产毒镰刀菌种群及产毒化学类型的定性PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.15 食品安全国家标准 食品微生物检验 霉菌和酵母计数 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 产毒镰刀菌经过提取 DNA 后，利用特异性区分引物，通过普通 PCR 判断该样品是否为禾谷镰刀 菌或亚洲镰刀菌。根据关键特异基因 Tri11 来区分该样品是否产生 3ADON 、 15ADON 或者雪腐镰刀烯 醇 NIV 化学型。 4 试剂和材料 4.1 水：应符合GB/T 6682 中一级水的规格。 4.2 PDA 培养基：按GB4789.15规定。 4.3 CTAB缓冲液:55 mmol/L CTAB、1400 mmol/L氯化钠（NaCl）、20 mmol/LEDTA、100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），121℃高压灭菌20 min，储存于2℃～8℃。 4.4 TE缓冲液。 4.5 RNA酶溶液（5μg/μL）。 4.6 蛋白酶K（20mg/mL）。 4.7 Tri饱和酚。 4.8 酚：三氯甲烷：异丙醇（25：24：1）；三氯甲烷：异戊醇（24：1）。 4.9 异丙醇。 4.10 区分禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌引物 Fg16F: 5′-CTCCGGATATGTTGCGTCAA-3′ Fg16R: 5′-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3′ 预期亚洲镰刀菌扩增片段大小为 4 97 bp ； 预期禾谷镰刀菌扩增片段大小为 410 bp 。 4.11 区分3A-DON、5A-DON和NIV化学型引物 Tri11-CON: 5′-GACTGCTCATGGAGACGCTG-3′ Tri11-3ADON: 5′-TCCTCATGCTCG GTGGACTCG-3′ Tri11-15ADON: 5′-TGGTCCAGT TGTCCGTATT-3′ Tri11-NIV: 5′-GTAGGTTCCATTGC TTGTTC-3′ 预期产3ADON毒素类型扩增片段大小为334 bp；产15ADON毒素类型扩增片段大小为279bp ；产NIV 毒素类型扩增片段大小为497 bp。 4.12 无水乙醇。 4.13 DNA Ladder：可以清楚区分100 bp～1000 bp的DNA片段。 4.14 dNTPs混合溶液：将浓度为10 mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液 等体积混合。 4.15 Taq DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液及25 mmol/L氯化镁溶液。 4.16 50×TAE缓冲液：称取484g Tris，量取114 mL冰乙酸，200mL 0.5 mol/L EDTA，溶于水中，定 容至2 L。分装后高压灭菌备用。使用时用水稀释成1×TAE电泳缓冲液（工作液）。 4.17 加样缓冲液。。。。。。以下内容略