纳微米技术应用于药物传递具有多种形式如脂质体、纳微米囊泡、粒子等,这 些剂型可W改变药物的吸收、分布与代谢等药代动力学参数,在生物展学领域具有 很好的应用前景。本课题研究了几种纳微米制剂的制备工艺及其在骨科治疗、免疫 疫苗领域的应用可行性。 本研究主要分为W下H部分: 1.淫羊藉巧纳米粒:通过超声透析方法制备了载淫羊蕾巧PLGA纳米粒。实 验结果表明制备淫羊蕾昔纳米粒粒径均一性良好,具有良好的生物相容性及缓释性 能;淫羊蕾昔纳米粒对成骨细胞的生长无明显影响,但能明显促进成骨细胞分化。 2.骨铅向纳米囊:通过改性明胶与丹宁酸的交联作用稱合硬膜板法,制备了 纳米囊。ZIF-8为硬模板调控囊壁和囊腔的结构,纳米囊表面连接铅向分子。通过 此法制备的纳米囊粒径均一,既具有缓控释性能亦具有很好的骨亲和能力。 3.OVA蛋白微囊:通过丹宁酸与铅离子配位作用锅合硬模板法制备微囊。碳 酸巧为硬模板调控囊壁和囊腔的结构。通过此方法制备的微囊具有pH响应性,包 载OVA蛋白的微囊通过体外实验具有良好的生物相容性,细胞毒性较小。 关键词:纳米粒,纳米囊,微囊,缓释 1 北京帖和区学院硕丄-毕业论义 ABSTRACT Microspheresandnanotechnologyfordrugdeliveryhavedifferentformsof nanotechnologysuchasmicroparticles,liposomes,nanoparticles.These打ewdm呂forms canchangethepharmacoki打eticparameters,andmaycrossbiologicbarriers,andhas prospectfiiUireinmanyfields.Thispapermainlys1:udiedtheapplicationof na打otechnologyintreati打gbo打ediseasesandvacci打efield.了herearethreepartsof experiments. 1.Icariin-loadedPLGAnanoparticles:Prepari打gicariin-loadedPLGAnanoparticles byultrasiflcationemulsificationandstudyingtheirphysicalandchemicalproperties, realeaseoficariin,andtheeffectonhuma打osboblastcellsinvitro.ThePLGA nanoparticleshaduniformparticlesizeandshowed化ebestpropertyofsustanedrealease andbiocompat化ility.Meanwhile,theicariinnanopaticleshadnoeffectondiegrowthof MG-63cells,butpromotedthedifferentiationofos化oblastcells. 2.Nanocapsulesforbo打etargeting:Adualhard-templateapproachcouplingwith coordinationi打teractionbetweenTAandmodifiedgelatinwasexploi1:edtoprepare na打ocapsules.之IF-8wasutilizedtomediatetheformationofnanocapsulesshelland lumen.Thesurfacenanocapsuleswereconnectedtotargetmolecules.Thenanocapsules haduniformparticlesizeandshowedthebestpropertyofsustanedrealease.Meanwhile, 也eyshowedgoodboneaffinity. 3.OVA-loadedmicrocapsules:Adualhard-templateapproachcouplingwith coordinatio打interactionbetweenTAandA13+wasexploitedtopreparemiacrocapsules. CaC〇3wereutilizedtomediate化eformatio打ofnanocapsulesshellandlumen. Microcapsulespreparedbythisme化odwerepHresponsive.Byvitroexperiments, OVA-loadedmiacrocapsulesshowed1:hegoodbiocompat化ility. Keywords;打anoparticles,nanocapsules,miacrocapsules,controlledrelease 2 北京化和巧学院硕Jr 第一章纳微米制剂在骨疾病治巧及疫苗方面的应用 1前言 纳米、微米尺寸大小的颗粒物质,可作为载体包载或吸附活性药物成分。利用 微纳米载体包载药物具有W下的特性;如增加药物的分散性、提高生物利用度;增 强缓释作用;提高给药靴向性等。目前常见的微纳米载体有脂质体、纳米粒和微球 等。基于本文实验研究的内容,本报告主要重点阐述微纳米递送系统在骨疾病治疗 及疫苗方面的应用。 2微纳米递送系统在骨科治疗方面的应用 骨組织存在火量的巧,使其具有一些特殊的生物学性质如血流量低、密度大、 渗透性差等,这给临床给药带米一定难度,一般给药途径很难使药物到达病灶部位, 而全身给药虽能达到药效,却对非骨组织造成严重的不良反应;另一方面治疗骨疾 病的药物多W亲脂性药物为主,如何提高他们的溶解度和生物利用度也是一大难题 1|,21近几年微纳米技术被越来越多地用于骨组织再生与修复,提高骨的植入愈合, 预防感染W。由于微/纳米颗粒具有尺寸小,表面积大,表面可修饰等特点,有望为 骨再生与修复创造新的复合材料和交付系统,克服传统治疗方法的局限。本文主要 从微/纳米颗粒载药体系,表面祀向修饰及微/纳米颗粒与支架材料的复合兰个方面 论述微纳米技术在骨组织再生与修复方面的应用。 2.1微/纳米粒介导的药物传递 治疗骨疾病的药物主要分为传统药物,细胞生长因子,基因药物H大类。运用 微/纳米载体包载药物,从而改变药物的物理化学性质(亲疏水性,溶解度,释放特 性等),从而影响药物的生物药剂和药代动力学性质,达到増强药物疗效、降低药 物副作用、提高治疗指数的目的W。 2丄1生长因子 骨再生过程中存在多种骨生长因子的表达W,Tatsuyana认为在骨缺损处的多种 骨生长因子缺乏或活性不足是影响骨再生的重要原因,局部应用外源性生长因子可 3 北京协和區学院硕± 促进骨缺损修复W。已知的骨生长因子有包括BMP在内的转化生长因了家族TGFs、 血管内皮生长因子VEGF、成纤维细胞生长因子FGF等。这些生长因了间接或直接 地促进祀细胞的趋化、增殖、分化及细胞内基质形成或偶联骨形成和骨吸收W。然 而生长因了生物活性不稳定,半衰期短,易发生流失、降解和吸收,不能充分发挥 其骨诱导作用t8’9i,因此许多研究将其与微纳米载体材料相结合应用于骨创伤修复。 Oldham等将人重組BMP-2蛋白包载进PLGA,生长因了可通过PLGA的降解缓慢 释放出来W1。利用碳酸巧纳米粒包载PDGF研究其对骨再生的影响,研究发现它比 单独使用PDGF因子更能促进骨再生。另有人研究了利用壳聚糖,哲基憐灰石等作 为载体包载生长因子,取得了一定的效果tW。 2丄2传统药物 治疗骨的药物多是亲脂性药物,如淫羊蕾昔,他汀类(辛伐他汀、洛伐他汀) 等,然而水溶性都比较差,生物利用度差。淫羊蕾巧主要通过上调BMP2的表达, 激活BMP2-Smads-Rimx2和BMP2-P38MAPK信号通路,最终促进表达成骨特异蛋 白如碱性磯酸酶(ALP)、骨钩素(OCN)、骨诞蛋白巧S巧促进骨再生。研究发 现曰服含淫羊蕾昔的相关药物时,淫羊蕾巧在胃中较为稳定,但当它到达肠道时会 很快代谢,致使其曰服利用率低。采用新型纳米材料将淫羊蕾巧制备成磁性纳米脂 质体,不仅提高了它的利用度,还增强了祀向治疗效果他巧类药物在肝脏中通 过抑制3-経基-3-甲基戊二醜辅酶A还原酶闲MG-CoA)活性抑制胆固醇生成,从而 通过诱导成骨活动导致骨的生成U6’I然而研究发现他汀类药物在体内会产生一些 副作用如横纹肌溶解及较差的水溶解性tW。有研究者合成两亲性共聚物BPPD包载 辛伐他汀,结果显示辛伐他汀纳米粒可1^减少体内辛伐他汀的摄入总量及控制它的 释放,促进骨生成tW。 2.1.3基因药物 由于基因治疗是通过基因转染产生和分泌生长因子,比生长因子制备更简单, 使用更方便。基因转染方法包括物理、病毒、化学方法,病毒载体具有高的转染效 率的同时可能带来一些危害如激活人体免疫、激活癌基因表达、一种病毒基因与另 一种病毒基因的重组及有限的基因装载能力PW。通过微/纳米颗粒携带基因转染可 减少这些问题及提高转染效率。微/纳米颗粒具有亚细胞的尺寸,能有效地被细胞内 吞,通过细胞内吞作用,实现核酸向细胞内的转运,进入细胞的微/纳米颗粒可W快 速从溶酶体中逃出来,使基因免受多种酶的消化降解pil另外,微/纳米粒还可通过 转运通道穿过血脑屏障及骨血屏障。微/纳米介导的骨基因转染主要可W分为DNA 体外转染植入体内P21,体内转染P33,及siRNA传递。DNA主要是一些骨生长相关 因子的基因序列。不同于DNA,siRNA主要用于致使鞭基因沉默,主要研究其在 4 北京协和区学院硕-上 骨肿瘤及抑制破骨细胞形成中作用P4’25l。胶原蛋白、超基憐灰石、PLGA等都可作 为基因的载体材料。 2.2骨祀向微/纳米粒 骨组织的主要成分为哲基憐灰石,哲基磯灰石形式存在于骨基质中的巧占人 体总巧量的99%。与径基磯灰石有特异亲和力,能与骨巧结合的分子可作为骨祀向 的导向物和载体,从而使药物选择性地作用于骨细胞PW,减少其他组织的副作用。 将纳米粒与鞭向分子相结合,能使药物顺利抵达骨病变部位,从而提高治疗效果, 降低不良反应。对骨有亲和力的分子主要可W分为四环素类药物、双麟酸类化合物 及其他一些化合物。这些分子本身可作为载体材料或吸附、化学连接在微/纳米颗粒 表面,从而达到靴向作用。 2.2.1四环素类化合物 四环素有较强的形成金属配位的能力,能与哲基磯灰石中的Ca2+络合能 沉积于骨組织,对骨有很好的亲和力。四环素可通过化学合成与一些药物连接,如 与转移生长因子TGF通过聚乙二醇偶联,与P-雌二醇通过了二醜偶联等,但是 并不是所有研究都表明合成的新化合物一定能在体内水解释放出药物发挥药效。 Wang等将聚丙交酷乙交醋(PLGA)与四环素CTQ相连,然后通过溶剂乳化法制备 的TC-PLGA纳米粒可W用来包载骨治疗相关药物如辛伐他汀,用于治疗骨质疏松, 结果也表明形成的纳米颗粒具有很好的骨细胞相容性,对骨亲和力较大,包载的药 物能缓慢地释放,在高骨密度处聚集。 2.2.2双勝酸类化合物 側OH HO、占fi/OH 〇 ' /;x々〇RiR2 图1双麟酸化学结构式 双隣酸类是另一类对骨有亲和力作用的化合物,它本身具有一定的抗肿瘤作 用。如上图所示,其分子结构中R2为可变的脂肪侧链,其改变可影响双麟酸的活 性(主要为抑制破骨细胞的形成),民1一般为哲基,可与二价阳离子如Ca2+、Mg2+、 Fe2+等形成配位化合物,骨的主要成分为巧决定了它能与骨相结合,P-C-P键是产 生骨靴向活性的必要条件PD’W。Sung等合成PLGA-Aln(Ain为阿仑隣酸钢)和 PLGA-PEG分子,后通过透析法制备了表面修饰的PLGA嵌段共聚物纳米粒,表面 5 北京化和巧学院硕.It 修饰分别为阿屈隣酸盐和聚乙二醇(PEG),研究表明PEG作为纳米粒的亲水性表 面,可W避开民隨细胞的吞隨,而纳米粒的骨吸附能力与阿屈麟酸盐的含量正相关, mPEG链越长,骨吸附能力越似321。Cong则采用PLGA-PEG分了制备纳米粒,通 过酷胺化反应将阿仑隣酸轴连接到纳米球上,形成骨祀向纳米球Oelzner等制 备了氯屈麟酸盐脂质体,用于治疗抗原性关节炎,大鼠体内试验表明,氯屈麟酸盐 脂质体能祀向初级和中级骨松质的破骨细胞。 2.2.3其他一些化合物 一些结构中存在醜胺基邻位择基和綾酸的五元小杂环化合物也具有径基稱灰 石亲和性,如4-幾基-3-姪基-1,2-化哇tW。Hu等用17(3-雌二醇巧2)修饰纳米粒表面, 铅向治疗骨质疏松pel。另有研究发现寡狀对経基稱灰石有一定亲合力,且氨基酸序 列的不同对骨亲和力不同P7lZangG等制备出一种能与骨形成部位低结晶矿盐特异 性结合的(AspSerSer)6-脂质体,能对成骨细胞进行祀向递送tW。化等利用H肤天 冬氨酸修饰PLGA-PEG纳米粒表面,结果表明修饰过的纳米粒相对于未修饰的纳米 粒对哲基磯灰石的吸附作用更强twi。 2.3微/纳米颗粒复合支架的构建 一般应用与骨组织工程的支架材料需要符合W下条件:无毒性、良好的生物相 容性、适宜的力学性能、适于细胞生存植入等。而单一的材料很难满足组织工程中 对支架材料的需求,将不同材料进行复合,获得性能优良的支架材料,成为当前支 架材料研究的热点twi。微/纳米粒子具有更大的比表面积,且在骨支架高聚物基质中 的结构更接近天然骨的组织结构,具有更好的力学性能和生物活性。研究表明,骨 支架中加入微/纳米粒子有利于其植入后与自然骨实现力学匹配,有效避免了传统支 架材料植入可能造成的应力刺激吸收和屏蔽问题W’42l。同时,包载药物的微/纳米粒 通过持续释放药物可W克服既往移植材料无骨诱导作用的缺点,使骨质缺损得到尽 快修复。如Webster研究发现PLGA复合纳米碳酸巧材料提高了材料的生物活性、 降解率和力学性能另有研究表明,骨与微/纳米粒接触后能实现更快的骨矿质沉 积fW。也有研究将rhBMP-2/PLGA-NP与可吸收的固定材料食合在一起,随着吸收 材料的降解过程中rhBMP-2持续释放,促进骨质修复。Pan等人将怪基磯灰石纳米 粒加入BMP-2修饰的PLGA-[Asp-PEG]n支架上,用于体外培养兔骨髓间充质干细 胞,结果表明,此支架明显提高细胞的粘附性并且具有很好的生物相容性、骨传导 性和骨诱导性wsi。同样有些载药纳米粒存在爆发性突释现象,利用复合材料可降低 释放速度,避免炎性反应。Soon等将BMP硫酸软骨素纳米粒附着于Ti表面,研究 结果显示BMP可W持续稳定释放四周,且没有明显突释现象。 6 北巧化和巧学院硕i: 3微纳米递送系统在疫苗方面的应用 免疫佐剂能非特异性增加机体的特异性免疫应答,能増加抗原免疫原性或改变 免疫反应类型,而本身无抗原巧tw。免疫佐剂与疫苗结合使用,佐剂能增强疫苗抗 原的免疫原性,增进抗原与黏膜之间的传递W及免疫接触,促进免疫能力较弱人群 中的免疫应答,同时还能诱导机体先天性免疫应答促进免疫细胞增殖分化,减少接 种疫苗次数等W1。理想的免疫佐剂需无毒或毒性小;能刺激机体体液/细胞免疫应答; 无自身免疫应答能力;无致癌致崎危险WS’W等;适用于各种疫苗等,然而常见的佐 剂还无任何一种能满足多种要求。尤其蛋A多肤等新型疫苗的出现,传统佐剂铅(佐 剂及MF59)的应用受到很大的限制,不适用于一些新型疫苗,如同一些高纯度小 分子蛋A抗原结合使用时无法产生足够的抗体应答W1,对细胞免疫调节也较弱,迫 切需要研究新型佐剂满足新型疫苗的需求。近几年来对佐剂的研究己经逐渐从传统 到新型,单一化到多元化的转变。将微纳米技术运用于佐剂的开发已成为研究新型 疫苗的热点。这里主要介绍了微纳米载体的材料选择,微纳米载体作为佐剂的优势 及与免疫系统的相互作用。 义1微纳米载備料的选择 许多可降解及生物相容性好的多聚物可被用于微纳米载体的制备,载体可通过 将疫苗负载或吸附于表面从而达到作为疫苗佐剂的目的。目前研究微纳米载体材料 常用的有无机材料稱酸巧及有机材料壳聚糖,PLGA等。磯酸巧比传统铅佐剂具有 更好的生物降解及生物相容性,且能很好地刺激Thl细胞的免疫应答,主要针对机 体对EB病毒及2型单纯疮疹病毒的免疫应答He,Indrajif等制备巧纳米颗粒 负载病毒蛋白或多核巧酸物质,免疫动物实验显示巧纳米颗粒作为黏膜免疫佐剂具 有巨大潜力,能很好地刺激体液及细胞免疫tw’ssi。另有研究表明表面修饰氯化巧的 碟酸巧纳米粒能很好地保护负载的DNA不被机体血清中的有效成分降解壳聚 糖是天然可降解的生物材料,生物相容性好且本身具有一定的免疫佐剂活性,因此 在疫苗递送系统中具有很好的应用前景壳聚糖可根据需要制备成纳米或微米级 颗粒。Silltter对壳聚糖的佐剂应用可行性进行了研究,表明负载OVA蛋白的壳聚 糖纳米颗粒能显著提高体液免疫应答水平,且H甲基化的壳聚糖免疫效果更好,能 一次免疫就产生OVA特异性抗体PSI。另有研究表明壳聚糖亦可负载DNA疫苗,且 转染效率与分子量相关,高分子量转染效率更高PLGA、PLG都是高分子材料 聚合物,制备成微球纳米的方法较相似,如乳化-相分离法、纳米沉淀法、溶剂挥发 7 北京化和区学院硕i: 法[^-621。1/}八因是经FDA认证的具有生物降解性及生物相容性的有机聚合物而研 究较多,利用PLGA制备的微球纳米粒等具有很好的稳定巧和安全性,易被吞隨细胞 吞隧,已被用于吸附各种抗原包括质粒DNA、重组蛋白W及免疫刺激寡核巧酸[63’641 Tobias采用PLGA包载破伤风类毒素制备成微球,动物实验思示PLGA可保护抗原, 延长释放时间,并能有效抵抗破伤风毒素的入侵tW。Shen等通过复乳溶剂挥发法制 备不同的PLGA纳米粒证明PLGA纳米粒能够携带抗原进去胞质,通过MHC-I类 分子交叉呈递tW。PLA与PLGA—样具有很好的生物安全性,Almerida将抗原吸附 至PLA微粒表面,在小鼠免疫实验中获得很好的效果Ataman-onal研究表明相 对于弗氏佐剂,p24蛋A吸附于PLA纳米颗粒后更易引起Thl免疫应答[681。 3.2微/纳米佐剂的优缺点 微/纳米佐剂具有与病原体相似的尺寸及结构,反应活性高,吸附能为强,能 很好地与抗原提呈细胞(APCs)相作用,利用微/纳米粒作为免疫佐剂具有传统佐 剂不可比拟的优势。首先,抗原装载进粒子中可避免酶降解和变性;微/纳米可促进 APCs对抗原的吞隨,促进抗原作用和细胞介导的反应;微纳米材料可通过多种方 式引起抗原交义呈递,从而激活CD8+细胞;通过调整粒子特征(表面电荷、大小 及结构等)有针对性地鞭向或可控释放抗原;微/纳米佐剂还可实现肿瘤抗原和免疫 增强剂的共输送,高效地作用于同一抗原呈递细胞,更有效地激活机体免疫反应, 杀伤肿瘤细胞,使疫苗的效率得到极大的提高研究常见的微/纳米佐剂主要有: 脂质体、微球、胶束等这些微/纳米佐剂既是疫苗的递送工具又作为佐剂。如 脂质体,研究表明其能够显著增强机体的体液免疫应答和细胞免疫应答,且能与其 他佐剂联合使用,刺激巨蹈细胞分泌忙-12、止-6、IFN-Y等,诱导CD8+细胞为主 的免疫反应它的佐剂效应主要依赖于脂质双分子层、表面电荷、结构成分等。 如将LMTP-PE及MDP-VAD包裹进微脂粒能激活巨略细胞和单核细胞,对骨肿瘤 细胞具有一定杀伤作用t78’79l。Shizuma等用阳离子脂质体包裹DNA疫苗在小鼠体 内既能诱导非结构蛋白3(NS3)的Thl和Th2应答,还能分泌非特异性正-12产物, 具有一定的抗肿瘤性tsw。微纳米粒表面可修饰及改性,通过表面修饰可影响抗原与 APCs细胞之间的相互作用,从而影响摄取率Nakamura利用精氨酸八聚物(细 胞膜穿透狀)修饰脂质体能提高交叉呈递效率t833。PLGA表面连接特异靴向分子如 阿仑勝酸钢,可将抗原运送到特定部位如骨肿瘤病化区发挥作用,针对骨肿瘤免疫治 疗fMl。而利用一些聚合物制备的pH敏感纳米佐剂,被DCs细胞摄取后进入内体 酸性环境下,可与内膜颤合,从而将抗原释放到胞质fM’sw。作为疫苗佐剂,微/纳米 粒展现巨大的潜力,但实际应用中存在一些问题如包封率,大小均一性,存储稳定 8 北京化和区学院硕:^ 性等,有待改进。 4本谋题的研究背景 4.1淫羊蕾昔、辛伐他巧在骨疾病治疗研究中扮演着重要的角色,可W诱导骨 再生,治疗骨质疏松,骨肿瘤等疾病。故本文W淫羊蕾巧及辛伐他汀做为模型药物 进行微纳米药物制备工艺研究。辛伐他灯和淫羊蕾昔两类药物在水中分散性不好, 口服利用度低,生物利用度很低。PLGA是经FDA认证的具有生物降解性及生物相 容性的合成有机聚合物,作为天然可降解的生物高分子材料明胶具有很好的生物相 容性和安全性。利用这两种材料,研制了两种药物制剂:PLGA纳米粒及改性明胶 纳米囊,有望成为新的骨疾病治疗的新型制剂。 4.2新型疫苗多为DNA、蛋A质多肤,安全有效,但免疫效果较差,且需要 借助其他手段刺激免疫应答达到较好的免疫效果。作为最广泛使用的佐剂侣盐并 不适用于新型疫苗,且主要诱导体液免疫,缺失诱导细胞免疫应答。本文试图通过 微纳米技术将侣佐剂微米纳米化,W期提高蛋白多狀疫苗的免疫反应。 本文课题主要分为W下H部分: 1、通过超声透析方法制备载淫羊蕾巧PLGA纳米粒,采用透射电镜、粒度分 析仪表征纳米粒的形态大小,体外释放实验检测纳米粒子的缓释性能,且研究其对 人成骨细胞的影响。 2、通过模板法及配位方法制备改性明胶纳米囊,采用透射电镜、粒度分析仪 表征纳米粒的形态大小,W辛伐他汀为模型药物,体外释放实验检测纳米粒子的缓 释性能。纳米囊表面修饰祀向分子阿仑麟酸钢,研究其对骨成分的亲和性。 3、通过模板法及配位方法制备pH响应性TA-A1微囊,采用透射电镜、粒度 分析仪等表征纳米粒的形态大小,WOVA为模型抗原,体外释放实验检测微米囊 的缓释性能。研究TA-A1微米囊细胞毒性、与树突细胞的相互作用及动物模型构建。 提取忙-23蛋白,为后续微囊加入止-23调节免疫反应打下基础。 9 北南邮和巧学院倾1- 5