项目名称： 非整合人诱导性多能干细胞（iPS）及相 关技术用于 β 地中海贫血治疗的研究 首席科学家： 潘光锦 中国科学院广州生物医药与健 康研究院 起止年限： 2012.1 至 2016.8 依托部门： 中国科学院 一、关键科学问题及研究内容 1、安全高效，具有临床实用性的非整合iPS新技术的优化及建立。 安全高效获得非病毒非整合iPSC的新技术 建立综合的诱导系统获得非病毒非整合的iPSC：利用mRNA及microRNA诱 导体细胞获得iPSC，筛选能够加速iPSC重编程的小分子化合物及蛋白；筛选高 效的iPSC诱导培养液。在此基础上，建立综合的诱导系统获得非病毒非整合的 iPSC。 iPSC的鉴定：核型、基因表达、体外分化能力、体内多能性检测等多方面 检测iPSC是否符合干细胞的标准；分子水平检测外源基因的插入；测序分析iPSC 的基因组稳定性。 建立非病毒非整合小鼠ESC样的人类iPSC（ESC-like-iPSC） 筛选能够稳定培养 ESC-like-iPSC的培养环境：通过传统的病毒诱导获得小 鼠ESC样的人类iPSC（ESC-like-iPSC）；筛选小分子化合物稳定培养 ESC-like-iPSC；筛选mRNA及microRNA支持ESC-like-iPSC的自我更新； 建立非病毒非整合ESC-like-iPSC：开发诱导获得ESC-like-iPSC的诱导系 统；在全基因组表达、小RNA表达等方面比较两种不同的iPSC的差异。 2、利用体外受精胚胎建立多株正常人及地贫病人的ES细胞系。 对比地贫iPS及ES，评价iPS多能性，安全性等应用指标。 建立非整合β地中海贫血病人iPS细胞库，约含各突变类型β地中海贫血iPS 细胞株50～100株。 优化和完善建立人胚胎干细胞的技术体系，并在此基础上建立地贫胚胎干细 胞库。本研究拟对现有的胚胎干细胞培养技术进行改进：利用不同发育阶段的IVF 废弃的胚胎（从桑椹胚到孵出的晚期囊胚）分离的人ESC细胞进行均一性研究， 寻找最优化的细胞分离时间；通过对人源性的饲养层细胞及无饲养层培养体系进 行优化，建立安全、稳定的人胚胎干细胞系技术平台。并在此基础上，建立不同 突变类型β地中海贫血人胚胎干细胞株10株以上。 非整合β地中海贫血病人iPS细胞与地贫胚胎干细胞比较性研究。对比研究 地贫ES及iPS，建立其表观遗传和基因表达的数据库。利用基因芯片及高通量 DNA测序技术，对比检测地贫iPS与ES在SNP，DNA 甲基化(DNA methylation)， 组蛋白修饰(Histone Modification)，外显子序列(Exon Sequencing)等方面的差 异。全面评价iPS在全能性，表观遗传学，基因组完整性，相关功能性细胞分化 的能力等，明确造血分化用iPS的全能性，安全性等应用标准。 3、研究修复地贫iPS的突变基因。探讨和评价经基因修复等操作 后iPS的基因组及表观遗传的稳定性，多能性及安全性等指标。建立 多样性的非整合地贫iPS细胞库。 利用基因重组技术修复突变基因。基因修复后iPS基因组及表观遗传学稳定 性的研究。通过基因芯片的技术手段检测基因修复后iPS的SNP，CNV等代表基 因组稳定性的指标。并进行外显子测序(Exon Sequencing)来确定有无重要基因 发生突变等。利用CHIP结合高通量测序技术确定经体外基因修复后的iPS在组蛋 白修饰，DNA甲基化等表观遗传方面的稳定性。 基因修复后iPS多能性的维持。研究经体外基因操作后，iPS维持其多向分 化潜能的能力。通过非定向的分化手段如裸鼠体内畸胎瘤的形成，体外类胚胎 （EB）的形成等手段对比基因修复前后地贫iPS的分化潜能。并通过定向分化的 方式如，神经分化，血液分化等对比探讨iPS在基因修复过程中的多能性维持。 4、iPS功能性血液分化的研究及基于动物模型的功能评价。 利用与不同人造血组织来源的的基质细胞，包括间充质干细胞共培养系统， 优化建立iPS的功能性血液分化及造血干、祖细胞体外扩增实用性技术。建立基 于动物模型的造血干细胞分化，移植及安全性多功能的评价技术和指标。 采用不同造血组织来源人间充质细胞与人胚胎干细胞及iPS细胞共培养诱导 造血分化，与目前较常用的EB形成及小鼠或其它组织来源的基质细胞共培养体 系进行诱导效率的比较，筛选有效提高造血干细胞诱导效率的iPS细胞分化培养 条件。 利用体外细胞长周期培养、单细胞培养分化实验以及体内NOD/SCID鼠造血 重建实验、骨髓竞争移植实验等， 与脐带血HSC细胞比较，评价多种来源的iPS 分化来源的HSC/HPC体内定向归巢、造血重建等生物学功能。比较iPS细胞来源 的造血干细胞与脐血造血干祖细胞向造血各系细胞分化，尤其是红系分化能力， 并对相应的调控机制进行探讨，侧重研究Wnt3a、PGE2等分子的调控作用。 通过全基因组表达及表观遗传学分析，比较地中海贫血iPS细胞来源的造血 干细胞与几种体内分离的造血干祖细胞，尤其是脐带血造血干祖细胞在编码及非 编码RNA基因表达，DNA甲基化及组蛋白乙酰化等方面的差异，并用实时定量 PCR加以验证。根据实验得到的结果，选择20－30个目的基因进行干预，研究 候选基因对造血干细胞细胞增殖，多能性和分化潜能等功能的影响。 比较不同来源的间充质干细胞（MSC）作为滋养层细胞并辅以不同细胞因 子的混合培养体系对iPS诱导获得的HSC/HPC细胞体外扩增的作用，建立可以保 持HSC/HPC细胞多能性功能并显著提高干细胞数量的培养条件，以满足临床移 植应用的要求。 二、预期目标 总体目标： 由于遗传导致的β-地中海贫血是严重危害广东等地区的地方性疾病，目前尚 无根治手段。本项目的总体目标是探讨利用病人来源的无DNA整合污染的iPS， 通过基因修复联合血液分化的技术途径，探讨建立一套从β-地中海贫血患者的 iPS诱导到突变基因原位修复，再到修复后造血干细胞分化的完整技术，为β-地 中海贫血患者的移植治疗提供大量自体来源的造血干细胞奠定基础。同时也明确 iPS实际应用的可行性及安全性等指标，本项目的完成不仅能够明确iPS及相关技 术用于β-地中海贫血治疗的可行性，也为其他一些遗传病的治疗起到重要的借鉴 作用。 五年预期目标： 1、建立包含有不同突变类型的地贫病人特异性的无外源DNA整合的iPS库及 ES细胞库。约含各突变类型β地中海贫血iPS细胞株50～100株。同时利用废弃的 体外受精的胚胎建立10～20株地贫病人的ES细胞株及5株正常人的ES细胞株用 于对比研究。 2、建立非整合β地中海贫血病人iPS细胞与地贫胚胎干细胞的基因组稳定性， 表观遗传和基因表达的数据库。明确iPS在组蛋白修饰，DNA甲基化等表观遗传 方面的稳定性。 3、建立实用性的地贫突变基因修复的技术平台。明确经基因修复后的iPS 在基因组，表观遗传等方面的稳定性及干性维持等特性。 4、建立高效诱导iPS细胞分化为造血干细胞的培养条件及对分化的造血干细 胞造血重建及移植功能的鉴定动物模型和相关技术； 5、优化造血干细胞体外扩增的培养体系，筛选和鉴定可以用于对干细胞功 能和安全性进行评价的分子标记物和指标； 6、通过对比研究iPS诱导分化和脐带血来源的造血干细胞在基因表达及表观 遗传特征上的差异，揭示针对造血干细胞增殖，分化及自我更新等生物学特性的 新的调控机制。 7、优化非整合病人特异性iPS技术，将目前诱导效率提高100倍左右，诱导 时间缩短到2周左右。建立非整合小鼠ESC样的人iPS细胞技术。明确新型人iPS 细胞的多能性，基因组稳定性，安全性等指标。 8、 培养研究生30名，建立一支具有国际竞争力的，由优秀中青年科学家组 成的创新团队，培养一批能独立从事高水平科学研究的后备力量； 9、在本领域的国际代表性学术SCI刊物上发表20余篇学术论文，其中影响因 子高于5的不少于10篇，培养博士生15名，博士后5名。 10、举办一次相关的国际性学术研讨会。 三、研究方案 技术路线： 研究方案： 1、探讨优化建立快速高效的获得iPS的技术 1）在mRNA诱导iPSC的基础上，通过筛选小分子化合物及蛋白，加速非病 毒非整合iPSC的诱导；这一套系统我们已经在进行尝试。接下来筛选促进重编 程的microRNA，建立传统的iPSC（EpiSC-Lik-iPSC）。 2）利用Dox-inducible的载体（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）诱导体细胞获 得ESC-Lik-iPSC；筛选能够维持自我更新的小分子，我们已经开始相关实验； 在此基础上，尝试建立非病毒非整合的ESC-Lik-iPSC。 可行性分析 该部分研究内容的主要承担者赵小阳博士所在的实验室在以往的研究中，开 展了大量的诱导iPSC的研究工作，利用病毒为载体高效诱导获得iPSC；并对 iPSC在分子水平上进行了充分的鉴定，以及完备的多能性检测。本实验需要开 展的工作中， mRNA的体外合成与纯化、microRNA的筛选工作我们已经开展， 进展良好。在我们之前的研究中，成功筛选出小分子化合物并改进了iPSC的诱 导环境。对于本课题的各个环节，我们进行了细致的研究探讨，认为我们基本掌 握相关技术，因此，我们有信心成功完成预期目标。 创新性分析 目前，国内外有多个实验室开展新的不依赖多能性因子的纯药物诱导方式， 试图提高iPSC的诱导效率；本课题的特色在于，从提高iPSC的诱导速度出发， 筛选新的小分子化合物及蛋白等各种因子，建立一个快速高效且简单易于操作的 iPSC诱导系统，降低iPSC表观遗传突变及基因组不稳定的风险，力争应用于将 来的临床实验中； 新型的iPSC不仅在理论上有大的突破，还将为iPSC未来的临床应用提供基 础，这种iPSC将在大规模培养、基因修复、分化上拥有巨大的优势。与国内外 其他实验室相比，本研究更注重与实际应用联系起来，以推动iPSC最终应用于 临床治疗。 2、建立非整合β-地中海贫血的病人特异性iPS库。 本部分内容拟在该部分研究内容的主要承担者潘光锦博士以前的实验室建 立起来的episome的方法的基础上进行一定程度的修改用来获得地贫病人的 iPS。该技术将诱导因子克隆到含有EB病毒来源的复制元件的质粒上，该质粒主 要含有两种特殊元件，一是质粒复制子-oriP, 另一是复制蛋白-EBNA .通常情况 下，普通质粒在进入细胞后如果不能整合到细胞的基因组中便不能进行自我复 制，很快就会被细胞内的酶降解。但是该系统的特点是当质粒导入细胞内后能够 表达复制蛋白EBNA，表达后的EBNA随后结合在复制子oriP 上，使该质粒在染 色体外不经过整合就可进行复制。这样就保证了由该系统携带的诱导蛋白在整个 iPS细胞诱导过程中得到表达。在获得iPS细胞后，导入的episome质粒由于不进 入整合到基因组，经过一定时间的体外培养便可逐渐失。最终通过筛选便可得到 完全无外源DNA整合的地贫病人的iPS细胞。另外，除此之外，我们也会充分利 用研究内容1里面优化后的iPS技术建立非整合的病人iPS。 可行性分析 利用episome的方法建立人非整合iPS的技术首先由申请者潘光锦博士后的 实验室－Thomson实验室报道。潘博士回国后已经成功的建立了该系统，并在 诱导过程，培养基方面进行了优化，目前诱导效率不错（见工作基础），在进一 步优化的基础上完全保证本部分研究内容的可行。另外，本项目的申请单位之一 南方医科大学南方医院及广西医科大学第一附属医院血液内科具有丰富的病人 来源，因此，本部分内容是完全可行的。 创新性分析 本项研究内容利用非整合技术建立包含有多种突变类型的多样性的β地贫的 iPS细胞库。为将来的进一步应用研究打下了基础，目前国内外尚无建立非整合 地贫iPS细胞的报道。 3、优化和完善建立人胚胎干细胞的技术体系，并在此基础上建立地贫胚胎 干细胞库。 本研究拟对现有的胚胎干细胞培养技术进行改进：利用不同发育阶段的IVF 废弃的胚胎（从桑椹胚到孵出的晚期囊胚）分离的人ESC细胞进行均一性研究， 寻找最优化的细胞分离时间；通过对人源性的饲养层细胞及无饲养层培养体系进 行优化，建立安全、稳定的人胚胎干细胞系技术平台。并在此基础上，建立不同 突变类型β地中海贫血人胚胎干细胞株50株以上。 可行性分析 该部分内容的承担团队海南省人类生殖与遗传重点实验室（海南省生殖医学 中心）在2006年已经建立了稳定的海南人群的胚胎干细胞株，成为国内首批建 立人胚胎干细胞的单位之一，并赠送给中科院上海细胞所、中科院广州生物医药 与健康研究院、郑州大学第一附属医院、西安交通大学医学院第一附属医院等多 个研究单位使用。在使用人源性的饲养层细胞及无饲养层培养体系方面积累了一 定的经验，发表干细胞相关SCI论文2篇；具有非常完善的地中海贫血基因诊断 体系、胚胎体外培养体系以及胚胎干细胞分离体系。该中心目前每年新鲜IVF周 期约2000例，具有丰富的地贫胚胎来源，因此能够保证这部分内容的顺利完成。 创新性分析 1）目前人们已经建立数百个人类胚胎干细胞株，并且发现他们在分化能力 上有差异，究其原因，细胞异质性可能是其中之一。经典的人胚胎干细胞株是从 囊胚阶段的内细胞团分离建立的，本课题设计从不同发育阶段的胚胎（从桑椹胚 到孵出的晚期囊胚）分离人ESC，并分析它们在表观遗传、基因转录及分化特性 上的差异。这一研究结果将为优化胚胎干细胞分离体系提供新的理论基础并为人 胚胎干细胞的生物学特性研究提供新的信息。 2）导致β地贫发病的β珠蛋白基因改变类型多样，在我国人群中，已发现的 β地贫突变类型已达到40种以上。虽然国内已有部分单位建立了一些人疾病胚胎 干细胞株，但尚无中国南方人群各种β-地贫突变的系统的疾病胚胎干细胞库的报 道。本研究将首次建立较完整的β地贫突变疾病胚胎干细胞库，为地贫发病机制、 地贫突变修复、iPS细胞造血分化等多项研究提供必须的疾病细胞模型。 4、非整合β地中海贫血病人iPS细胞与地贫胚胎干细胞比较性研究。 对比研究地贫ES及iPS，建立其表观遗传和基因表达的数据库。利用基因芯 片及高通量DNA测序技术，对比检测地贫iPS与ES在SNP，DNA 甲基化(DNA methylation)，组蛋白修饰(Histone Modification)，外显子序列(Exon Sequencing) 等方面的差异。全面评价iPS在全能性，表观遗传学，基因组完整性，相关功能 性细胞分化的能力等，明确造血分化用iPS的全能性，安全性等应用标准。 可行性分析 人iPS生物安全性问题是iPS细胞用于临床治疗必须解决的问题，是当前干 细胞研究的一个重大方向。本团队结合自身的资源优势和特色，建立中国南方地 区非整合β-地贫特异性iPS细胞及胚胎干细胞库，并利用这些模型开展比较研究， 这些研究成果将为建立iPS的全能性，安全性等应用标准提供依据，同时也能够 把基因突变与个体化的疾病表型联系起来，为揭示β地贫的发生机制，寻求新的 治疗途径提供基础，在理论和技术上都是可行的。 创新性分析 通过比较不同突变类型及不同个体的新型β-地贫特异性iPS细胞及胚胎干细 胞株在向造血系等方向分化的过程中的表观遗传及基因转录水平等方面的差异， 将为研究地贫较宽的临床表现谱提供理论依据，对地贫的发病机制具有重大的理 论创新意义；同时，这一比较研究也将为明确iPS细胞治疗地贫的安全性标准提 供数据。 5、iPS细胞功能性血液细胞分化及临床应用的血液细胞对比性研究。 1）采用不同造血组织来源人间充质细胞与人胚胎干细胞及iPS细胞共培养 诱导造血分化，与目前较常用的EB形成及小鼠或其它组织来源的基质细胞共培 养体系进行诱导效率的比较，筛选有效提高造血干细胞诱导效率的iPS细胞分化 培养条件。 2）利用体外细胞长周期培养、单细胞培养分化实验以及体内NOD/SCID鼠 造血重建实验、骨髓竞争移植实验等， 与脐带血HSC细胞比较，评价多种来源 的iPS分化来源的HSC/HPC体内定向归巢、造血重建等生物学功能。比较iPS细 胞来源的造血干细胞与脐血造血干祖细胞向造血各系细胞分化，尤其是红系分化 能力，并对相应的调控机制进行探讨，侧重研究Wnt3a、PGE2等分子的调控作 用。 3）通过全基因组表达及表观遗传学分析，比较地中海贫血iPS细胞来源的 造血干细胞与几种体内分离的造血干祖细胞，尤其是脐带血造血干祖细胞在编码 及非编码RNA基因表达，DNA甲基化及组蛋白乙酰化等方面的差异，并用实时 定量PCR加以验证。根据实验得到的结果，选择20－30个目的基因进行干预， 研究候选基因对造血干细胞细胞增殖，多能性和分化潜能等功能的影响。 4）比较不同来源的间充质干细胞（MSC）作为滋养层细胞并辅以不同细胞 因子的混合培养体系对iPS诱导获得的HSC/HPC细胞体外扩增的作用，建立可以 保持HSC/HPC细胞多能性功能并显著提高干细胞数量的培养条件，以满足临床 移植应用的要求。 5）通过体外造血集落形成实验以及体内NOD/SCID移植模型的建立，比较 iPS细胞来源的造血干细胞与脐血造血干祖细胞向造血各系细胞分化，尤其是红 系分化能力，并对相应的调控机制进行探讨，侧重研究Wnt3a、PGE2等分子的 调控作用。 可行性分析 利用基质细胞共培养诱导多能干细胞的造血分化已是广泛应用的技术，目前 已在课题申请单位中国医学科学院血液学研究所成功建立。项目申请单位拥有国 内国际领先的间充质细胞库，为课题提出的研究内容提供了丰富的细胞资源。间 充质干细胞及其CM用于脐带造血干细胞的体外扩增体系及干细胞功能测定的动 物模型也已在课题申请单位建立。同时申请单位对造血干细胞临床移植经验，为 制定评价功能性和安全性的干细胞标准提供重要的技术保障。因此这部分的研究 内容开展是可行的。 创新性分析 本项研究内容利用人造血组织来源的基质细胞及间充质干细胞诱导iPS细胞 的造血分化，免除分化过程与动物来源的细胞接触的过程。这一培养体系均有创 新意义。间充质干细胞用于多能干细胞分化的造血干细胞的扩增尚未有报道对干 细胞的移植应用有重要意义，目前国内外间相关报道。 课题设置 课题间关系 围绕项目所要解决的关键科学问题、主要研究内容和预期目标合理设臵课 题。需说明课题设臵的思路、各课题间的有机联系以及与项目预期目标的关系； 本项目围绕研究目标及拟解决的科学问题，设立了下述4个有机联系的课题。其 中课题1主要是探讨和优化更具临床实用性的获得非整合病人特异性iPS的技术， 包括优化组合已知的诱导因子，诱导条件，摸索建立高效，实用，安全的获得病 人特异性的非整合iPS细胞的技术体系。该课题完成好可以为课题2和3提供高效， 实用，安全的iPS技术以建立多样性的iPS细胞库。鉴于目前很多报道提到iPS细胞 在基因组稳定性，分化效率，移植后安全性等方面与正常的ES细胞都存在着较大 的差异及具有应用的不确定性，课题2 的研究内容主要是以同一标准在同一实验 室建立具有同一性的多株ES及iPS并进行相关比较性研究，以明确iPS细胞有其是 地贫来源的iPS在稳定性，分化效率，移植后安全性等方面的指标，明确iPS的标 准。该课题与课题３充分合作，是整个项目的基础。课题3在