ICS 11.220 B 41 DB33 浙江省地方标准 DB33/T 2268—2020 猫细小病毒PCR检测方法 PCR detection technique for feline panleukopenia virus 2020 - 06 - 30发布 2020 - 07 - 30实施 浙江省市场监督管理局 发布 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009的规定编写。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：张红丽、徐 辉、赵灵燕、周彩琴、吴贇竑、黄 靖、吕见涛、刘爱军、刘 霞、 吴雪军、孙冰冰、章杭建。 猫细小病毒PCR检测方法 1 范围 本标准规定了猫细小病毒PCR（polymerase chain reaction）的实验条件、操作步骤、结果判定。 本标准适用于猫细小病毒（猫泛白细胞减少症病毒）的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猫细小病毒 Feline panleukopenia virus，FPLV 属细小病毒科，细小病毒亚科，牛犬细小病毒属成员，又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性胃肠 炎病毒或猫瘟病毒。 4 实验条件 4.1 试剂 4.1.1 要求 除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为符合GB/T 6682要求的灭菌双蒸水或超纯水。 4.1.2 试剂 4.1.2.1 核糖核酸酶（20 mg/mL）。 4.1.2.2 10%十二烷基磺酸钠溶液。 4.1.2.3 10 mg/mL蛋白酶K。 4.1.2.4 Tris-盐酸饱和酚（pH 7.6）。 4.1.2.5 酚-氯仿-异戊醇混合液（25：24：1）：在一灭菌棕色瓶中按25：24：1比例分别加入酚、氯 仿、异戊醇。 4.1.2.6 3 mol/L乙酸钠（pH 5.4）。 4.1.2.7 琼脂糖。 4.1.2.8 10 μg/μL溴化乙锭（ethidium bromide， EB）：溴化乙锭20 mg、加灭菌双蒸水至20 mL 充 分溶解混匀而成。 4.1.2.9 50×TAE缓冲液：羟基甲基氨基甲烷（Tris）242 g、冰乙酸 57.1 mL、0.5 mol/L乙二铵四乙 酸二钠溶液（pH 8.0）100 mL，加灭菌双蒸水至1 000 mL充分混匀。 4.1.2.10 加样缓冲液：聚蔗糖25 g、溴酚蓝0.1 g、二甲苯青0.1 g，加灭菌双蒸水至100 mL充分溶 解混匀而成。 4.1.2.11 2.5 mmol dNTPs（deoxyribonucleoside triphosphates，脱氧核糖核苷三磷酸）。 4.1.2.12 10×PCR Buffer。 4.1.2.13 DNA分子量标准：DL2000。 4.1.2.14 引物序列FPLV-F：5'—CCAGCTGAGGTTGGTTATAGTG—3'；FPLV-R：5'—GGTGCATTTACATGAAGTCTT GG—3'。 4.2 仪器设备 4.2.1 高速冷冻离心机：要求最大离心力在12 000.rpm以上。 4.2.2 PCR扩增仪。 4.2.3 核酸电泳仪和水平电泳槽。 4.2.4 微波炉。 4.2.5 分析天平。 4.2.6 恒温水浴锅。 4.2.7 冷藏冰箱和低温冷冻冰箱。 4.2.8 微量移液器。 4.2.9 凝胶成像系统（或紫外透射仪）。 4.2.10 高压灭菌锅。 4.2.11 超净工作台或生物安全柜。 5 操作步骤 5.1 样品的采集和处理 5.1.1 采集动物粪便、肛拭子、全血或肠道等组织样品并进行处理: a) 肛拭子、粪便（加适量PBS）等样品经4 ℃ 5 000 rpm/mi