ICS 65.020.30 B41 DB33 浙江省地方标准 DB33/T 2254—2020 猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒 双重荧光定量RT-PCR检测方法 Method of duplex fluorescence quantitative RT-PCR for the detection of porcine epidemic diazhangchenrrhea virus and transmissible gastroenteritis virus 2020 - 04 - 08发布 2020 - 05 - 08实施 浙江省市场监督管理局 发布 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江农林大学。 本标准主要起草人：宋厚辉、邵春艳、王晓杜、孙静、姜胜、周莹珊、杨永春、程昌勇、章先、杨 杨、卫芳芳。 猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量RT-PCR检 测方法 1 范围 本标准规定了猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和猪传染性胃肠炎 病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）双重荧光定量RT-PCR检测方法的材料准备、样 品采集、核酸提取、荧光定量RT-PCR检测及结果判定。 本标准适用于猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：达到阈值的循环数（Cycle threshold） DEPC：焦磷酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid） PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline） PEDV：猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus) RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid） RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction） TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus） 4 试剂和材料 4.1 除非另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。0.01 mol/L PBS和DEPC 水配制中所使用的水应符合GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法中一级水的要求。 4.2 Trizol：RNA抽提试剂，2 ℃～8 ℃保存。 4.3 氯仿：2 ℃～8 ℃预冷。 4.4 异丙醇：2 ℃～8 ℃预冷。 4.5 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，2 ℃～8 ℃预冷。 4.6 DEPC水：配置方法见附录A。宜直接购买商品化DEPC处理的无DNA酶和RNA酶的水。 4.7 0.01 mol/L PBS，pH7.2：配制方法见附录A。 4.8 2×One Step RT-PCR buffer（内含PCR buffer、dNTPs和Mg2+）。 4.9 DNA聚合酶：HS Taq DNA聚合酶（5 U/μL）。 4.10 反转录酶预混物（内含RNase抑制剂）。 4.11 阳性对照：猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎灭活病毒混合物。 4.12 阴性对照：DEPC水。 4.13 用于RT-PCR反应的引物浓度为10 μmol/L，探针浓度10 μmol/L，其序列分别为： PEDV上游引物F：5’-GCTTGCTTCGGACCCAGAGG -3’；。。。。。。以下内容略