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DB33T_2246-2020猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法PDF

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PCR DB33 DB33T
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更新时间:2021/12/9(发布于山东)

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文本描述
ICS 65.020.20 B 44 DB33 浙江省地方标准 DB33/T 2246—2020 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法 Real-time PCR detection technique for Japanese encephalitis virus 2020 - 03 - 03发布 2020 - 04 - 03实施 浙江省市场监督管理局 发布 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009的规定编写。 本标准由浙江省农业农村厅提出。 本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:浙江省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人:谢荣辉、张传亮、吴赟竑、徐辉、刘霞、周蕾、柴娟、虞一聪、王雅婷、周彩 琴、赵灵燕、刘爱军、吴雪军。 猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法 1 范围 本标准规定了猪流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)荧光定量RT-PCR检 测的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。 本标准适用于猪流行性乙型脑炎病毒核酸的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 猪流行性乙型脑炎 由猪流行性乙型脑炎病毒引起的一种急性传染病。猪的主要临床症状表现为高热、流产、死胎和公 猪睾丸炎。 3 实验条件 3.1 仪器 3.1.1 高速冷冻离心机。 3.1.2 荧光定量PCR仪。 3.1.3 生物安全柜。 3.1.4 组织研磨仪。 3.1.5 微量移液器。 3.1.6 冰箱。 3.1.7 涡旋混匀器。 3.1.8 高压灭菌器。 3.2 试剂 除特别说明外,本标准所用试剂均为分析纯,所有试剂均用无RNA酶污染的容器分装。 3.2.1 Trizol:核糖核酸(Ribonucleic acid, RNA)提取试剂。 3.2.2 氯仿:4 ℃预冷。 3.2.3 异丙醇:4 ℃预冷。 3.2.4 焦炭酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate ,DEPC)水:取DEPC 100 μL,加超纯水至100 mL,室 温过夜,121 ℃高压灭菌15 min,分装,冻存备用。 3.2.5 75%乙醇:用75 mL无水乙醇,加DEPC水至100 mL,混匀,-20 ℃预冷。 3.2.6 商品化的一步法实时荧光RT-PCR反应试剂:One Step Prime Script. RT-PCR Kit(Perfect Real Time,TAKARA),含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ、Ex Taq HS(5 U/ μL)、PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ和无RNA酶的水。 3.2.7 0.01mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS):取Na2HPO4.12H2O 2.9g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.2g, NaCl 8g, 溶于800 mL去离子水中,充分搅拌溶解,滴加浓盐酸将pH调节至 7.4,然后加去离子水定容至1 L,高温灭菌30 min,室温保存。 3.2.8 引物和探针,其序列如下:上游引物:5-GGCTCTTATCACGTTCTTCAAGTTT-3,下游引物:5- TGCTTTCCATCGGCCYAAAA-3,探针:5-FAM-AGCATTAGCCCCGACCAAGGCG-TAMRA-3。 3.2.9 阳性对照:猪乙型脑炎活疫苗(SA14-14-2株)。 4 操作步骤 4.1 样品采集 4.1.1 脑组织:选择代表性病症的病死猪,应无菌采集脑组织,将采集到的脑组织装入到无菌离心管 中并编号,冷藏送检或-20 ℃以下保存备用。 4.1.2 全血:用无菌注射器耳静脉采集猪血,将采集到的猪血装入到无菌离心管中并编号,冷藏送检。 若不能及时送检的全血,应分离血清置于-20 ℃以下保存备用。 4.2 样品处理 4.2.1 取待检脑组织适量装入到无菌离心管中,按1:10体积加入PBS,置于组织研磨仪中充分研磨。 将研磨后的样品,反复冻融3次,10000。。。。。。以下内容略