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右旋磷霉素微生物手性转化可行性研究报告DOC

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更新时间:2021/9/2(发布于广东)

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文本描述
右旋磷霉素微生物手性转化可行性研究 摘要 本报告研究的目的物左旋磷霉素(简称磷霉素,(+)FOM)作为一种新型抗生素, 虽然发现时间不长,但应用范围却日益广泛。目前,磷霉素的工业生产主要是应用化学 合成方法,但该方法存在原材料浪费、环境污染和成本较高等一系列问题。因此开发新 的合成途径势在必行。利用微生物进行手性生物转化具有立体选择性高、副产物少、反 应条件温和及环境友好等优点,因而探索通过生物转化方法将右旋磷霉素((+)FOM)转化 为左旋磷霉素的可行性,是很有必要的。 东北制药集团股份有限公司有较长的磷霉素生产历史,其长期堆放废弃右旋磷霉素 的库房附近的土壤中,可能含有符合我们要求的转化菌株,即具有右旋磷霉素转化能力 的菌株。 基于此设想,本报告探索采用“底物利用与产物耐受复合筛选模型”,在土壤细菌 悬液中分别筛选、富集以右旋磷霉素为唯一碳源的混合菌体以及抗左旋磷霉素的混合菌 体,两类细菌混合后再经两种转化培养基培养以实现右旋磷霉素至左旋磷霉素的手性生 物转化。通过左旋磷霉素敏感菌生物检测,土样B和E的两种转化培养基的发酵液均 能产生抑菌圈,再通过薄层层析(TLC)法对这两种土样的发酵液与左旋磷霉素标准品做 层析比对,得到了相同的比移值,可以初步认定发酵液中有左旋磷霉素产生,从而证明 了右旋磷霉素至左旋磷霉素生物催化途径的真实存在。 在本研究中,土样B的混合菌体经转化培养基I培养后得到的发酵液能够产生最 大的抑菌圈,抑菌圈直径为2.23cm,根据左旋磷霉素标准品产生的抑菌圈直径与左旋 磷霉素浓度的对数值之比,计算该发酵液中的左旋磷霉素含量为38.9(ig/mL,转化率为 0.39% o 本研究对土样B和E发酵液中的菌株进行了分离、纯化,根据菌落的不同特征, 将得到的百余个单菌落大致分为五类,选取其中的8株进行16SrRNA序列分析鉴定。 关键词;磷霉素;外消旋产物;右旋磷霉素利用菌;左旋磷霉素抗性菌 -III- 东北大学硕士学位报告 Abstract The Study on Feasibility of Chirally Microbial Conversion of D-fosfomycin to L-fosfomycin Abstract As a kind of new antibiotic, fosfomycin has been recently recognized and then applied widely. Chemical method is mainly used in its production by now, but this chemical method has problems, such as, waste of raw materials, pollution of the environment and higher production costs. Therefore, it is imperative to develop new ways. Microbiological method has many advantages, such as high stereoselectivity, less by-products, mild reaction conditions and no pollution. Thus D-into L-fosfomycin produced by biological method has great potential. Northeast Pharmaceutical Factory is the biggest fosfomycin producer in China. We collected soil samples around the place where D-fosfomycin has been existed for a long time. The experimental steps were as follows: firstly, we filtered and enriched the mixed cells which could utilize D-fosfomycin as a sole carbon source and anti-L-fosfomycin from the soil suspensions. Secondly, the mixed cells were used to produce L-fosfomycin in two transformation mediums. Thirdly,detected by sensitive bacterial of L-fosfomation,the two fermentation broth of B and E soil samples could produced inhibition zone. And then, comparing the two fermentation broth to standard fosfomycin by the TLC, we could get the same Rf, so we could sure the L-fosfomycin can be produced in the fermentation broth. The fermentation broth which was cultured by the mixed cells of B soil sample in the transformation medium I could produce the largest inhibition zone, which diameter was 2.23cm. According to the ratio between the inhibition zone diameter of L-fosfomycin and the logarithm of L-fosfomycin's concentration, the L-fosfomation content in that fermentation broth was 38.9|ag/mLand the conversion ratio was 0.39%. The strains in the fermentation broth of B and E soil samples were separated and purificated. According to the different characteristics of colonies, we got more than one hundred single colony which could be devided into five categories, and eight strains were V- 东北大学硕士学位报告 Abstract selected for 16SrRNA sequencing analysis. Key words: fosfomycin; racemic products; D-fosfomycin utilization strains; L-fosfomycin resistance strains -VI- 东北大学硕士学位报告 目录 目录 独创性声明 I 摘要 III ABSTRACT v 第1章绪论 1 1.1磷霉素概述 1 1.1.1磷霉素的理化性质 1 1.1.2磷霉素的抗菌机制 2 1.1.3磷霉素耐药菌、抗性菌及产生菌的抗药机制 3 1.1.4磷霉素抗菌活性研究的新进展 4 1.2磷霉素合成研究现状及研究进展 5 1.2.1磷霉素的工业生产 5 1.2.2磷霉素的化学不对称合成研究状况 6 1.2.3磷霉素的生物合成代谢途径 6 1.2.4磷霉素的生物转化法合成研究进展 7 1.2.5右旋磷霉素的化学转化研究现状 11 1.2.6右旋磷霉素手性生物转化机理的推测 11 1.3环氧化合物的生物转化与合成 12 1.3.1环氧化合物的生物转化与合成 12 1.3.2异构酶 14 1.4发酵液中磷霉素的检测方法 15 1.4.1磷霉素的微生物检测方法 15 1.4.2磷霉素的薄层色谱分析方法 15 1.4.3磷霉素的离子色谱(IC)检测方法 16 1.4.4发酵液中磷霉素对映体纯度的测定方法 16 1.5本报告的立题基础和研究目的 16 1.5.1立题基础 16 -VII- 东北大学硕士学位报告 目录 1.5.2研究目的 17 第2章右旋磷霉素利用菌与左旋磷霉素抗性菌的筛选 19 2.1实验材料 20 2.1.1 菌株 20 2.1.2培养基 20 2.1.3主要试剂 21 2.1.4主要仪器 21 2.2实验方法 21 2.2.1 土样的采集 21 2.2.2以右旋磷霉素为唯一碳源的生长菌株的筛选 21 2.2.3左旋磷霉素抗性菌株的筛选 22 2.2.4应用混合菌系实现右旋磷霉素的手性生物转化 22 2.2.5发酵液中左旋磷霉素的检测与鉴定 24 2.3结果与讨论 24 2.3.1以右旋磷霉素为唯一碳源的生长菌株的筛选 24 2.3.2磷霉素抗性菌株的筛选 26 2.2.3应用混合菌系实现右旋磷霉素的手性生物转化 27 2.4本章小结 28 第3章利用土壤细菌悬液实现右旋磷霉素的手性生物转化..........29 3.1实验材料 29 3.1.1 菌株 29 3.1.2培养基 29 3.1.3主要试剂 30 3.1.4主要仪器 30 3.2实验方法 31 3.2.1菌体未经富集能否产抗生素的考察 32 3.2.2右旋磷霉素利用菌与左旋磷霉素抗性菌在土壤细菌悬液中的富集 33 3.2.3发酵液中左旋磷霉素的检测与鉴定 34 -VIII - 东北大学硕士学位报告 目录 3.2.4发酵液中磷霉素含量的计算 34 3.3结果与讨论 34 3.3.1混合菌体未经富集能否产抗生素的考察 34 3.3.2混合菌体在两种转化培养基中对右旋磷霉素的手性生物转化 35 3.3.3左方龙憐霄素的生物鉴定 44 3.3.4发酵液中磷霉素含量的计算 46 3.5本章小结 47 第4章右旋磷霉素生物转化菌株的鉴定 49 4.1实验材料 49 4.1.1 雌 49 4.1.2培养基 49 4.1.3主要试剂 49 4.1.4实验仪器 49 4.2实验方法 50 4.2,1菌株的分离 50 4.2.2 16SrRNA基因的序列分析 50 4.3结果与讨论 53 第5章结论与展望 59 5.1结论 59 5.2 臓 59 5.3报告创新点 60