应用单胃动物仿生消化仪评价小麦日粮添加木聚糖酶效 果的可行性研究 摘要 本试验利用第三代单胃动物仿生消化系统(SDS-III)观测添加木聚糖酵后小麦体 外消化率的变化与酶添加量间的关系,并用肉鸡排空强饲法验证加_■饲料仿生消化 率变化规律的重现性。旨在探讨单胃动物仿生消化系统用于评价加酵飼料的可行性。 试验共分三部分。 试验一仿生消化系统运行稳定性及鸭饲料仿生法消化估测值的实验室间平 行性研究 按照SDS标准操作流程,利用经软件和硬件升级改造后的SDS和模拟消化液 标准试剂盒,在本实验室条件下测定了 18个批次玉米-豆粕标准样品的干物质消化 率,分析测定结果的批内、批间变异度,并与中国农科院动物营养学国家重点实验 室的测定结果进行了可重复条件下的实验室间重演性和精度比较。结果表明,同一 批次内DMD最大绝对差值幼.9%,批内变异系数<0.59%;不同批次间,DMD最大 绝对差值幻.3%,批间变异系数《0.57%;两种原料的总变异系数切.59%。不同实验 室间,批内变异系数幼.66%,批间变异系数幼.79%;实验室内变异系数<0.84%,实 验室间变异系数幺1.7%;总变异系数<1.9%。在本实验室对两种饲料标样分别进行了 15次重复测定,玉米和豆粕DMD的最大绝对偏差控制在0.6%、0.9%之内的概■率 >99% (P<0.01)。以上说明本试验所用的SDS在本实验室运行稳定,测定结果与国 内同类实验室的结果具有可比性。 试验二用仿生消化系统(SDS)评价小麦中添加木聚糖酶效果的研究 试验选取4个不同产地的小麦样品,分别添加0、500、2000、8000和12500 U/g 5个剂量的木聚糖酶,共20个供试样品。每个样品测定时,并做添加与不添加内源 消化酶2种处理方式,利用SDS-III测定各供试样品的DMD,比较木聚糖酶添加量、 小麦来源和内源消化酶添加与否对测定结果的影响,旨在探讨添加木聚糖酵对小麦 体外消化率的影响规律。结果显示,添加内源消化酶虽然极显著提高了 4个来源小 麦的DMD测值(尸<0.01),但对小麦DMD测定结果的变化规律均无影响,4个小麦 样品添加与不添加内源酶DMD测值间的回归系数分别为0.751、0.758、0.789、0.679, 回归显著性概率均达到极显著水平(PO.Ol)。4个来源小麦样品的DMD均随着木 应用单胃动物仿生消化仪评价小麦日粮添加木聚糖酶效果的可行性研究 聚糖酶添加剂量的升高表现先升高后降低的趋势,每个小麦样品DMD最高值与最 低值之间差异均达到显著水平(P <0.05 )。但4个来源的小麦样品DMD测值对木聚 糖酶添加量的反应并不同步(P<0.05),表现出明显的差异性。综上可见,小麦DMD 测值与木聚糖酶添加剂量间呈现非线性关系,即存在对应DMD测值最大的最适木 聚糖酶加入量;超量添力n木聚糖酶对小麦DMD测值可能产生负面影响,本文暂称 为“高剂量负效应”。同时,小麦DMD最大测值对应的最适木聚糖酶加入量还可能 随小麦来源(品种)而异。利用SDS研究DMD测值与木聚糖酵加入量间的关系可 能并不需要加入昂贵的内源消化酶。 试验三用排空强詞法测定添力p木聚糖酶对肉鸡小麦养分消化率的影响 试验采用排空强饲法研究木聚糖酶添加剂量与小麦养分体内表观代谢率变化规 律的关系,旨在验证试驗二中利用SDS-III测出的小麦DMD与木聚糖酶添加量间的“高 剂量负效应”是否在体内法中重现,并通过深入分析体内和仿生消化前后主要成分的 变化,解释引起“高剂量负效应”的可能原因。进一步验证SDS-III用于评价加酵祠料的 可行性。试验选用18周龄以上,体重2.5±0.2Kg,健康成年黄羽肉用公鸡48只,设木聚 糖酶添加量和小麦来源2个因子,每个因子含3个水平,其中3个小麦来源分别为选用 试验二中的1号、2号、4号小麦,酶的添加水平为0、2000、12500U/g,共9个处理。 实验分两批次测定,第一批次每个处理设8个重复,第二批次每个处理设10个重复, 每个重复一只鸡。按照排空强饲法操作流程收集试验个体粪样,并测定各试验鸡内源 消化剩余物中主要养分的变化。结果显示,除粗灰分外,添力口木聚糖酶对小麦其他营 养物质代谢率并无显著影响(P>0.05),剂量效应不显著。主要养分的体外消化率与体 内代谢率相关性分析结果表明,二者的干物质和粗蛋白消化率呈显著正相关(戶< 0.01 ),但灰分和非淀粉多糖消化率呈显著负相关(尸< 0.01 )。无论体外消化或体内代 谢,干物质和粗蛋白均是小麦的主要成分,二者体内消化率和体外代谢率间的高度正 相关说明,添加木聚糖酶后,小麦体外消化率的变化规律在体内代谢中有类似表现, 但小麦NSP和动物内源蛋白生成量可能掩盖了部分相似性。同时体内法结果变异度大 也可能是掩盖木聚糖酶添加剂量效应表现的重要原因之一。综上说明SDS体外法可以 反映日粮主要成分的体内代谢率,但受NSP和灰分等指标的干扰,还有待进一步研究 以提高准确度。 关键词:仿生消化系统;小麦;木聚糖酶;体外评价;干物质水解率 II 英文摘要-ABSTRACT THE FEASIBILITY OF USING BIONIC DIGESTION SYSTEM TO EVALUATE THE EFFECTS OF XYLANANSE SUPPLEMENTATIONIN WHEAT-BASED ABSTRACT The dry matter degradibilities of 4 wheat samples of different origins were measured using a Simulated Digestion System ( SDS-III) after adding different levels of xylananse. The In Vitro digestibilities wre compared with that of In Vivo ones, which were generated from male broilers following Fasting-Force Feeding procedure. The feasibility of the application of SDS-III system in evaluating the effects of xylanase in wheat-based diets were discussed according to the accordance of In Vitro and In Vivo results. Trail 1 The stability of bionic digestive system and its collaborator}; study on the enzymatic hydrolyzate gross energy of duck-feeds The dry matter digestibilities of 18 corn-soybean based duck diet samples, which were provided by Institute of Animal Science, the Chinese Academy of Agricultural Science (Beijing) for collaboratory studies, were determined in our laboratory according to the standardrised SDS operational procedure. The intra- and inter- batch variabilities were analysed according to the results obtained in our lab. The reproducibilities and precision of measurements were compared between our results and that of the Beijing parallel lab. The results showed that the maximum absolute difference of DMD measurements from the same instrument were not more than 0.9% and 1.3% for intra-batches and inter-batches, respectively, and that of variation coefficients for intra-bathes, inter-bathes, and total samples were not more than 0.59%, 0.57%, and 0.59%, respectively. The variation coefficients of intra-bath, inter-bath were not more than 0.66%, 0.79%,and that of intra-laboratory, inter- aboratory, and total measurements were not more than 0.84%, 1.7% and 1.9%, respectively. Fifiteen repeative measurements of each of 2 feed samples verified that 99% of DMD varation could be controlled within 0.6% and 0.9%. In in 应用单胃动物仿生消化仪评价小麦日粮添加木聚糖_效果的口J行性研究 summary, the SDS-III system was operating stablely in our laboratory.The results we got had a higher comparability with that of collab. Trial 2 Evaluation the dosage-response effects of xylananse in wheat using SDS-III system (in vitro) The wheat samples from 4 different origins were selected, and different levels of xylanase followed by 0,500, 2000,8000,and 12500 U/g were incorporated into the 4 cultivars, thus,forming 20 test samples. In addition, each sample was tested either withendogenous enzymes addition or not. The validated SDS-III system was applied to evaluate the effects of xylanase levels, wheat origins as well as endogenous enzymes on the DMD of all tested samples. The results revealed that although endogenous enzymes significantly increased the digestibilities of the four wheat cultivars (P<0.01), the trends of DMD varations were similar to that of no endogenous enzymes addition counterparts. The regression coefficients of DMD between the paired treatments of the four wheat cultivars were 0.751,0.758,0.789 and 0.679, respectively (P <0.01). The DMD of the four wheat cultivars all showed an increasing-then-decreasiing pattern as the elevation of xylanase activities. However, the DMD measurements differed significantly between the minimum and the maximum in each of the four cultivars (jP<0.05). But the most effective dosage of added xylanase on DMD in the four cultivars were not thesame (尸<0.05). In summary, there was a non-linear association between DMD of wheats and the levels of xylanase added, and there was an optimal level of xylanase that could achieve the best DMD in each wheat. According to the dose-response pattern, once the xylanase exceeded the optimal level, the xylanase would have a negetive effect on DMD. Hence,we proposed the effect as negetive response-to-high levels of xylanase. Meanwhile, the DMD measurements also affected by the cultivars of wheat. The results indicated that endogenous enzymes might not required for the evaluation of the effects of xylanase on DMD of wheats using SDS-III system. Trial 3 The effects of xylanaseon digestibilities of wheat-based diets using Fasting-Force Feeding male broilers (in vivo) The effects of xylanase levels on apparent metabolic rate of wheat were evaluated in broiler chicken using the fasting-force feeding method. Moreover, the so-called 'negetive response-to-high levels of xylanase' found in thtin vitro expriment conducted in trial 2 IV 英文摘要-ABSTRAC 丁 were farther evaluated in this in vivo trial. The compostion changes of wheats using the SDS-III system and the animal model were examined extensively to elucidate the potential reasons for this observed response. The results from the in vivo experiment could also be used to verify the efficiency of SDS-III for the evaluation of the effects of enzymes on the digesitibilities of feedstuffs in vitro. Forty-eight healthy adult male yellow-feathered broilers with an average body weight of 2.5士0.2 kg,aged over 18 weeks were selectedand alloted randomly to a 2x3 factorial design with three wheat cultivars (i.e., wheat No.l,2 and 4) and three levels of xylanase (i.e., 0, 2000 and 12500 U/g). This experiment was run in twice, and there were eight and ten replicates in each treatment in the first and second run, respectively. In each treatment, there was one broiler. Both of the two runs were conducted following the standarised fasting-force feeding procedure, and the feces samples were collected from all the individuals. Apart from the significant effect of xylanase on the digestibilities of crude ash (P < 0.05), there was no effect observed on the rest examined nutrients. There was a significant positive association between the digestibilities of dry matter and protein obtained from thein vitro and in vivo studies. In contrast,a negative association was observed on crude ash and non-starch polysaccharides (P<0.01). Protein and dry matter are the major componets in wheat in both in vitro and in vivo studies. The results suggested the metabolic pattern of wheat obtained by SDS-III system and animal model was similar, and the variations between the .two methods may attribute to the NSP contents in wheat and the increased protein content in broilers from the endogenous origin. The large variations of the results obtained from thez^ vivo study may also attenuate the dose-response of xylanase in the digestibilities of wheat. In conclusion, the SDS-III system could be a useful tool to predict the digestibilites of the main componets in diets. However, the accuracy of the results could also be interfered by NSP and crude ash in the diets. KEY WORDS: bionic digestion system (SDS); wheat; xylanase; In Vitro; dry matter degradability v 缩略符号 缩略符号 英文缩写 英文全称 中文释义 AA Amino Acid 氨基酸 AOAC Association of Official Analytical Chemists 美国官方分析化学师协会 CP Crude Protein 粗蛋白 DM Dry Matter 干物质 DMD Dry Matter Digestibility 干物质消化率 NSP Non-Starch Polysaccharides 非淀粉多糖 SNSP Soluble Non-Starch Polysaccharides 可溶性非淀粉多糖 INSP Insoluble Non-Starch Polysaccharides 不可溶非淀粉多糖 VI] 引言 在现代养殖业中,饲料原料的生物学效价是确定动物营养需要量及优化饲料配方 的主要决策依据。据预测在我国饲料原料种类繁多且内在质量多变的情况下,用传统 生物学评定方法集中全国优势科研力量,完成饲料生物学效价的评定,至少需要数十 年,而且所获信息仅能反映有限的静态参数。因此,如何解决这一世界性的难题,已 成为多年来业界关注的焦点。自20世纪后期日本学者Fumya提出胃蛋白酶酶-小肠液体 系,即利用离体酶解法评定猪、鸡饲料的消化能后,很多研究学者都为开发简捷快速 的生物学效价评定技术投入了大量的精力,也取得了一定的研究成果。随着各种酶学 评定体系的不断完善成熟,近些年酶水解法的理论也得到了广大学者的肯定,但传统 酶水解法多以酶谱不详、活力不清的人工消化液为基础、以简单的实验室器材为测试 工具、以随意性的手工操作为手段。这也导致了以往体外模拟消化研究成果一直局限 于实验室而未能用于实际生产,实际上是未解决方法的标准化问题。为克服上述局限 性,中国农科院饲料营养价值评定课题组首先在摸清对不同生理阶段的单胃动物饲喂 不同类型日粮后的消化道酶活变异方面进行了系统的研究。在此基础上,成功幵发出 一种全自动模拟饲料在单胃动物消化道内的消化、吸收的装置及配套的仿生酶谱的消 化液试剂盒。该系统通过计算机自动模拟控制其水解过程,水解环境全程规范,明显 提高了测试效率和重演性。 为进一步论证基于SDS的酶学评定体系能否用于家禽饲料生物学效价的快速 评定和方法标准化的可行性。在动物营养学国家重点实验室前期大量测样工作的支 撑下,作为此研究体系的合作实验室,本试验以玉米豆粕(标准样品)为代表性测 定样品,通过对比两个实验室基于试剂酶的模拟消化液试剂盒所测结果差异,研究 SDS测定饲料干物质消化率的变异度,探讨该系统在不同实验室间测定代谢能的重 演性和精度。同时确定稳定参数,为仿生消化系统的应用提供硬性保障,也为确立 基于仿生消化系统定量测定饲料养分生物学效价方法标准化提供参考。 基于单胃仿生消化系统已取得的研究成果,本试验利用第三代单胃动物仿生消化 系统(SDS-III)观测添加木聚糖酶后小麦体外消化率的变化与酶添加量间的关系,并 用肉鸡排空强饲法验证加酶饲料仿生消化率变化规律的重现性,旨在探讨单胃动物仿 生消化系统用于评价加酶饲料的可行性。也为酶制剂的体外筛选和预测效果提供一种 新思路,研究结果对结合酶制剂进一步提高小麦作为非常规饲料资源的利用效率,缓 解当今饲料资源紧缺具有重要指导意义。 IX 文献综述-饲料营养价值评定方法的研究进展 第一部分文献综述 1饲料营养价值评定方法的研究进展 1.1传统生物学法 一直以来,人们多采用传统生物学法,即动物试验法来评定家禽饲料的有效能值, 并提出了 AME (表观代谢能)和TME (真代谢能)的测定方法。 Thaer和Einhof这两位法国科学家于1809年首次提出干草当量体系,从此各类饲 料营养价值的大小才得以相互比较,直到Haecker总可消化养分(TDN)体系和Kellner 淀粉价体系(即反映饲料净能值的克尔纳标准)的出现,饲料有效能的评定体系才真 正建立起来。之后,Hansson (瑞典)和Frederikson (丹麦)又建立完善了以大麦饲料 单位为基础的北欧饲养标准,最后直到Lofgreen、Garrett提出加州肉牛净能体系,饲 料有效能的评定体系才逐渐发展起来[1]。Hill和Anderson[2]提出用表观代谢能(AME) 的测定方法评定家禽饲料有效能,自此一种经典的代谢能评定方案得以确立。在真代 谢能(TME)体系建立之前,世界各国几乎都使用这种体系来评定饲料对家禽的能量 价值,但是该方法建立在假设家禽消化道中内容物在试验测定前后均保持一致,也就 是说试验期所收集的全部排泄物均来源于试验日粮的前提上。故表观代谢能测定方法 具有一定的局限性,它只有在测定釆食量较大,总排泄物多的试验动物(如产蛋鸡、 仔鸡及成年鸡饲料)的代谢能值时数据才相对准确,因为当实验动物采食量较大时总 排泄物相对较多,这样内源能值在全部排泄物能量中所占的比例就较小,这样表观代 谢能值与真代谢能值间差异变小甚至非常接近[3々。以上说明在运用表观代谢能值测定 方法时未考虑内源排泄物能值对真代谢能值的影响,因此理论上其实测值较待测饲料 真实代谢能值会偏低。尽管之后很多研究学者对此方法不断改进完善,其中包括排空 强饲法的应用[5]、指示剂的加入[6,7]以及改进排泄物收集方式[8,9]等,但这些都未能解 决由内源排出物所引入的生物学试验误差。同时AME测定方法的试验过程过于繁琐, 耗时、费力、耗资且试验条件不可控,测定结果重复性差等问题也日益突出[1()]。 随着研究不断深入又逐渐出现消化能、代谢能及净能(NE)体系[11,12]。值得一提 的是Sibbald于1976年建立的排空强饲法,它操作简单、投料准确、结果重演性好, 最重要的是该方法考虑到了动物体内源排泄物对总排泄物的干扰。实验用内源排泄物 能值来校正AME值,从而实现对饲料摄入量的准确测定并降低消化道中食糜残留对 收集排泄物的影响。在此之后,排空强饲法就广泛用于鸡饲料氨基酸利用率的测定[8, 131,并成为各国研究学者普遍认可的一种家禽饲料能量的评定体系。但测定真代谢能 1 应用单胃动物仿生消化仪评价小麦日粮添加木聚糖酶效果的可行性研究 时,还需设置内源对照,包括平行对照和自身对照。利用排空强饲法测定家禽的真代 谢能值,是基于家禽在强应激状态下的测定值与正常生理水平时一致、待测饲料原料 的特性和摄入量不影响用于进行校正的代谢粪能和内源尿能[14,15]以及饲料间不存在 协同或拮抗能量利用关系的这三个假设成立的基础之上。但之后很多学者都对这些假 设是否成立提出质疑,所以此真代谢能测定方法也只是一定程度上相对准确的代谢能 值测定方法[16]。 目前国际上普遍釆用的测定鸡饲料代谢能的方法有三种,即传统全收粪法…,⑶、 排空强饲法[5]和欧洲建议方法20],这些方法都是基于“准确投喂和无损失收集排泄 物”的原则测得待测饲料的代谢能值。另外还有指示剂法、套算法[21,22]和回肠食糜法[23, 等。 以上多种饲料能量生物学效价评定体系的方法均受到饲料、环境、动物本身和试 验方法等因素的干扰,这导致这些圣物学法在家禽饲料有效能值的评定结果上存在很 大的变异和争议[21」5_28]。比如传统全收粪法中试验动物釆食量的不可控影响代谢能值 测定结果的准确性[⑶、指示剂法中不稳定的指示剂回收率[3()]、套算法中不同基础曰粮 可能会导致代谢能值变异较大[22]以及回肠食糜法中由于试验动物需要接受手术这种 非正常生理状态可能会有所影响代谢能值等等[31],这些都是不同国家间饲料代谢能值 迟迟无法统一的原因[32]。 1.2化学分析法 鉴于上述传统生物学法评定饲料生物学效价时存在的的诸多缺陷及不足之处,同 时饲料中纤维素、粗蛋白、粗灰分等常规成分会影响饲料的有效能值(两者存在相关 关系)。因此可以考虑根据饲料常规营养物质含量来估计、预测其营养价值,这种方法 即是化学分析法[33]。自从美国学者HaeCker1914年创立TDN体系以来,许多研究者都 对利用可消化养分来估测饲料有效能值进行了研究[>37]。其中有一些国内外学者尝试 通过饲料化学成分分析[3841]来获取饲料养分的相关化学信息,并以此为基础建立不同 类型的数学模型[16,4二43],从而实现饲料生物学效价的快速评定。该法操作简单成本低, 己被世界各国广泛采用。^40屯311[44]于1987年首先创建了以纤维指标为主效应因子的 估测方法,随后Noblet[4M6^立了以酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维为主要预测因子的 预测方程,我国著名学者Zhang[47]&通过结合粗纤维等与饲料总能实现了对饲料的代 谢能值的预测。 化学成分预测法虽然具有测试方便、成本低的优点[48],但它也存在一些突出问题: 2 文献综述-饲料营养价值评定方法的研究进展 首先,化学预测法的预测模型只是基于若干特定的饲料营养素或非营养素而忽略了其 他营养素或非营养素对营养价值的贡献;其次,化学预测法只是简单的由饲料中营养 物质和非营养物质的种类和含量来估测饲料的有效能,它未能考虑饲料进入不同动物 胃肠道内真正消化吸收的过程;最后,绝大多数回归模型只是根据饲料中各种化学成 分和含量来估测有效能值[1(U6],也就是说这些模型没有考虑到各养分消化过程中可能 产生的变异等。综上说明化学分析法无法准确反映饲料养分在动物体内复杂的动态消 化过程,所以它预测的饲料营养价值也仅仅能作为参考值。 1.3近红外反射光谱分析技术 近红外光(Near Infrared, NIR)最早是由Herschel在1800年进行太阳光谱可见 区红外部分能量测量中发现的[49,近红外反射光谱技术(Near infrared reflectance spectroscopy,简称NIRS)是上世纪70年代由美国农业部(USDA)开发出的一■种非 破坏性瞬间分析技术,近红外光谱区与有机分子中含氢基团(OH、NH、CH)振动的 合频和各级倍频的吸收区一致,通过扫描样品的近红外光谱,可以得到样品中有机分 子含氢基团的特征信息,从而实现对饲料营养价值的快速评定。Valdes等利用此技术 测定了家禽全价饲料的AMEn,与动物实验法的测值相差较小[51,52]。 利用近红外光谱技术分析样品具有方便快速、高效准确、不破坏样品,不消耗化 学试剂,不污染环境等优点,因此该技术受到越来越多人的青睐。但其缺点有:测试 灵敏度较低相对误差较大;需要分析大量的常规体内或体外样品以建立标准方程;检 测极限一般为0.1%难以进行痕量分析[53,54]。故对于经常质量评定是十分经济且快速 的,但对于偶然一两次的分析或分散性样品的分析则不太适用。 1.4体外酶水解法 利用生物学法评定饲料生物学效价不仅耗时、费力,且不同研究学者测得的家禽 饲料有效能的结果存在较大变异[8,2(),55],因为生物学法测定结果受到饲料、环境、动 物及试验中人为因素等诸多干扰,同时生物学法难以在短期内对大量的饲料样品效价 进行评定。因此,需要寻求一种科学准确、简捷快速的体外方法来评定饲料生物学效 价,希望能一定程度上取代传统的动物试验。随着生化技术的不断发展,许多学者尝 试是否可以用酶水解法来进行饲料生物学效价的评定[56]。酶水解法即是,依据仿生学 的原理,建立一套在体外条件下模拟畜禽内环境的消化道温度、离子浓度、pH值等, 并对动物体内内源消化酶的分泌、胃肠道蠕动及养分吸收等相关参数进行模拟的体外 消化程序,通过研究酶水解物与待测饲料养分生物学效价之间的关系来估测饲料的生 3 应用单胃动物仿生消化仪评价小麦日粮添加木聚糖酶效果的可行性研究 物学效价。由于该方法测得的可消化千物质或酶水解物真能值等指标与生物学法的表 观代谢能(AME)或真代谢能(TME)高度相关,所用可用于估计或预测畜禽饲料有 效能值。酶水解法相对传统生物学法与化学分析法,大大简化了操作方法、测定环境, 且很大程度提高了测试结果的稳定性和重复性。依其发展进程,酶水解法可分为一步 酶解法、两步酶解法和多步酶解法[57#]。 1.4.1 一步酶解法 胃部的最主要消化酶是胃蛋白酶,该方法即利用胃蛋白酶在酸性及适宜温度条件 下,使蛋白质的肽键断裂,通过测定蛋白质的水解程度来判断蛋白质品质并预测其在动 物体内的消化情况。所用蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胰蛋白酶[61,62]和链霉蛋白酶等[55,63], 但主要还是以胃蛋白酶趴63]为主。 Sheffne等首次提出采用单一的胃蛋白酶对饲料进行体外消化,用以评定饲料中蛋白 质的生物学价值,该方法作为测定动物性蛋白质饲料消化率的经典方法,至今沿用。 Maga等[62]研究发现饲料蛋白在体外消化的初始阶段,氢离子释放速度与蛋白质消化之 间存在相关。McDonough等通过实验进一步证实了这种方法在预测蛋白质消化率方面的 准确性[64]。Meer等通过利用胃蛋白酶(pH=1.5的条件下)对多达89个饲料样品进行处理, 研究发现有机物质体外消化率与体内消化率高度相关,可以通过体外来预测饲料的体内 消化率。但是利用这种方法评定蛋白质饲料品质时很容易受到胃蛋白酶剂量和饲料粒度 等因素的影响[2()],胄蛋白酶水平直接对体外消化方法的可靠性产生影响,是评定饲料蛋 白质品质的关键[56,58]。为了克服此局限性使体外利用蛋白酶能够更准确的预测饲料的体 内消化率,需要对这种方法进行不断改进和完善。 总之,利用单一酶法在评定蛋白质的品质和预测其体内消化率方面都取得了一定效 果,但其仍存在很大的局限性。饲料蛋白质消化不但受胃蛋白酶的影响,还受胰腺和小 肠分泌的蛋白酶、淀粉和脂肪等其它养分消化程度以及各种饲料抗营养因子等多种因素 的影响。单一酶法仅模拟了蛋白质在胃内消化情况,而忽略了后段消化道对蛋白质消化 的影响。利用该方法评定种类相同、来源不同的蛋白质饲料的可靠性较低。同时,用该 方法评定饲料的营养成分也比较单一,仅限于蛋白质,而对能量、脂肪和淀粉等其它饲 料养分的消化情况不能进行预测。 1.4.2多步酶水解法 为了克服单酶法的种种局限性,各国研究学者不断探索更为科学合理准确的体外模 拟方法。随着对畜禽消化生理的深入研究,体外消化模拟技术也得到了发展,已由过去 4 文献综述-饲料营养价值评定方法的研究进展 的单一酶法发展为现代的多酶法。多酶法不但对胃消化过程进行模拟,而且还对胰腺分 泌消化酶、小肠消化以及大肠微生物消化等过程进行模拟,即由几种消化酶同时完成畜 禽体内消化过程。其中胃-小肠两步法是单胃动物体外消化模拟研究中应用最多的方法。 1.4.2.1胃蛋白酶-胰酶法 该方法主要是针对猪的体内模拟。首先用胃蛋白酶(猪)在酸性条件下水解饲料样品; 再用含有胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶等多种消化酶的胰酶(猪胰脏提取 物)在接近中性条件下继续完成小肠后段的消化过程,[65’66],最后再利用离心沉淀、过 滤透析等手段分离消化产物。 Bedford等在确保体外模拟环境与鸡体内消化道环境pH值接近的前提下,采用胃蛋 白酶-胰酶法,探讨了不同水平胃蛋白酶、胰酶以及消化时间对食糜粘性的影响,并成 功确立了一套本实验条件下鸡的离体消化法。Buchmann利用三氯乙酸沉淀经胃蛋白酶 和胰酶消化后的食糜溶液,假设离心后上清液中的蛋白质均己为消化部分,并以此计算 蛋白质消化率[67]。Boisen和Fernandez等在此基础上又作了进一步的改进和完善,利用改 进后的方法成功预测了猪体内蛋白质和氨基酸的回肠消化率[68,69]。这两位学者建立的胃 蛋白酶-胰酶离体法是猪体外消化模拟方法中较为典型且得到一致认可的方法。该方法 测定的饲料干物质、蛋白和能量营养指标体的外消化率与体内消化率之间均达到显著相 关,但与动物体内实际情况相比仍存在很多差距。因此如何能够科学合理的模拟已消化 养分在小肠内的吸收过程是单胃动物体外消化模拟技术的关键所在。为克服胃蛋白酶- 胰酶两步法消化产物积累对酶促反应的抑制作用,Mauron等和Robbins等建立了不连续 透析法,首次尝试将小肠消化过程放在透析袋内进行,并将透析袋浸泡在pH呈中性的缓 冲液中,这样消化产物不断透析出来进入缓冲液,明显降低了消化产物积累对酶促反应 的抑制作用,提高了饲料养分体外消化率。Cave等研究发现,利用半透膜去除消化产物 可明显提高体内与体外养分消化率的相关性,这进一步说明去除消化产物的重要性[7()]。 另外研究显示在去除消化产物体外消化方法中,透析袋的截留分子量和透析液流速是影 响饲料养分体外消化率的两个主要因素[7】]。但胃蛋白酶-胰酶两步法所使用的胰酶含有 多种消化酶,不同批次胰酶在组成上、活性间也存在较大变异,表现出消化酶活性的不 可重复性,因此无法实现模拟消化液的重复。 1.4.2.2胃蛋白酶-小肠液法 鉴于胰酶与肠液中各种消化酶组成与活性均存在不同程度的差异,为了进一步模 拟动物肠道的内环境条件,利用获取内源小肠液的方法逐渐为学者所采纳。畜禽采食 应用单胃动物仿生消化仪评价小麦曰粮添加木聚糖酶效果的玎行性研究 的饲料经过胃初步消化后,并通过胃运动分批转运到下一段消化道十二指肠。在这里 猪胰腺分泌的各种消化酶和肝脏分泌的胆汁等经由开口于十二指肠处的胰腺导管排人 消化道内,并与胃蛋白酶消化后的食糜混合,对饲料养分进一步进行消化分解。因此, 如果利用猪小肠液测定饲料体外消化率,除胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等 主要消化酶外,胰脏分泌的微量物质、肝脏分泌物及肠肽酶等一些影响养分消化的成 分均可通过猪小肠液来获得。这样可以使体外消化模拟过程与体内更接近,所测定结 果也更可靠合理。多酶体系最早使用小肠液模拟小肠进行体外培养的是Van Soest和 Goering, Lowgren等,他们成功估测了猪小肠淀粉、粗蛋白的利用率和日粮纤维的 降解率,也可用于比较猪饲料营养价值。但是Fumya等取得了突破性发展,通过在猪 空肠安装简单T-型瘘管采集空肠液,制备了猪小肠液冻干粉(PIF),实验研究了胃 消化期胃蛋白酶浓度消化时间、小肠消化期消化时间、猪小肠液贮存温度以及饲料样 品粒度对体外消化率的影响,结果显示七种日粮干物质和粗蛋白体外消化率与体内消 化率之间高度相关[72,73]。李小亭研究结果表明,釆用猪小肠液冻千粉代替鸡小肠液进 行饲料离体消化率和消化能测定,发现测得值和生物学法测定值间存在正相关,且相 关系数在0.862以上,达到极显著水平(P<0.01)。我国著名动物营养学家张子仪院士在 上世纪80年代针对该方法进行了系统的研究和改进,成功建立了一套标准化的操作程 序。尤其在猪小肠液的制备、体外消化过程参数以及各种可能影响预测体内消化率的 因素等方面均进行了研究。将小肠液制作成冻干粉,增加了消化酶活的贮存时间和操 作的方便性和灵活性,并建立了一套标准化的操作程序。利用该方法测定的饲料千物 质和能量体外消化率与粪表观消化率之间存在强相关,该方法现己用来预测鸡饲料代 谢能[42,43,74]。 胃蛋白酶-小肠液法中,最大的技术困境是小肠液酶活是否能保证前后一致,此方 法的小肠液来源于试验动物,活性不可避免会受到釆集部位、日粮营养水平、饲养环 境条件以及动物品种等诸多因素的影响,导致小肠液的消化酶的活力具有批次差异性, 进而产生实验误差挑战该方法的可靠性。另一方面该方法仅能模拟猪前段消化道(胃和 小肠)的降解过程,没有考虑到猪日粮中部分有机物质的降解情况,特别是忽略了曰粮 纤维可能被后肠微生物发酵降解的部分,这也是胃蛋白酶-小肠液法最大的局限性。 1.4.2.3三步酶水解法 尽管釆用两步酶解法测得的饲料消化率估测值与体内的实测值具有一定的相关性, 但它只能模拟畜禽消化道前段的消化过程,而畜禽日粮中部分有机物质的降解并未被考 虑进去,事实上,畜禽后段消化道内存在的微生物往往对饲料养分利用有着很大影响, 6 文献综述-饲料背养价值评定方法的研究进展 因此利用两步酶解法预测猪日粮养分表观消化率存在着一定的局限性。Kass等研究证 明,猪后段消化道微生物发酵产生的挥发性脂肪酸所提供的能量大约占日粮提供能量的 12%左右。因此,要想全面地对饲料潜在的消化能进行体外评价,十分有必要考虑微生 物发挥的作用。Fonty和Ahrens等实验发现猪后段消化道内微生物间和瘤胃微生物的组成 和发酵原理有许多相似之处,在此基础上,Veraeke等利用瘤胃微生物处理经胃蛋白酶 和胰酶消化后的食糜来模拟其在猪后段消化道的发酵过程,进一步证实可行[75]。Metz 等在胰酶消化阶段加入脂肪酶、胆酸盐和微生物淀粉酶以及纤维素酶,用pH=l的胃蛋白 酶和胰酶消化20种饲料和日粮,结果证实这样能够估测粪有机物质消化率,但精确度有 待提高。Boisen和Fernandez等也对此方法做了相关研究,证实与胃蛋白酶-胰酶-瘤胃液 法测得干物质和能量的消化率表现出很强的一致性,在此基础上两位研究学者于1997年 成功确立了一套模拟整个消化道体外操作程序,其主要特点是:完成胃和小肠阶段的消 化过程后,向消化食糜中加入一种复合酶(可水解饲料中的可消化纤维含有多种碳水化 合物水解酶)继续模拟食糜在大肠段的消化[68,76]。研究成果证实利用胃蛋白酶-胰酶-碳 水化合物酶三步法能够实现体外预测单胃动物饲料的消化能。 1.5仿生消化酶解法 饲料有效能值是制定畜禽饲养标准及优化饲料配方的首要技术参数,饲料能量生 物学效价的评定也是动物营养领域中世界性的“老大难”问题。众所周知,传统的动物 试验法始终存在耗时费力、重演性差的弊端,从而导致获得的信息不能满足现代化养 殖业与饲料工业中急需的关键性指标测试技术问题。欧、美、日等发达国家虽然不断 进行过体外消化技术方面的种种尝试,但一直缺乏模拟消化液试剂盒的生产工艺准则、 全程自控的酶水解环境,以及试剂盒的效价稳定保质系统。动物营养学国家重点实验 室一直致力于不同饲养环境、不同组合、不同畜禽对象下单胃动物消化生理、饲料营 养代谢规律方面的研究。在中国工程院院士张子仪显示的指导下,经过多次软硬件改 造和协作攻关,有针对性地在解决了猪禽消化道套管设计、瘘术、活体肠道内的食糜 流量及其体内消化液在不同外因条件下的酶活变异规律等技术难题之后,历时7年开 发出了第一、二代仿生消化系统样机,在此基础上经过不断改造升级研制成功了比现 行国家标准法更为精确,重演性更为稳定的第三代单胃动物仿生消化系统(SDS-III) 及配套的模拟消化液试剂盒,实现了适用于评定猪和鸡鸭饲料能量生物学效价的酶水 解总能值的全自动离体消化试验装置(图1-1、1-2、1-3) [7781]c该系统克服了传统生 物学法中存在的对试验动物要求高、饲养成本昂贵,难以批量测试的限制,并且在仿 生酶谱、自动程控技术方面国际领先。这一技术不仅将为全面改革现行静态表格制的 饲养标准体系,开发新一代单胃动物(猪、鸡、鸭)动态营养需要量动态数学模型提 7 应用单胃动物仿生消化仪评价小麦日粮添加木聚糖酶效果的可行性研究 供有力的科研方法与工具,而且在我国饲料工业、养殖业上的广泛应用后将为动物营 养科学研究成果及时推广应用于生产实际提供现代化手段[78]。 单胃动物仿生消化系统(SDS-III)系统的设计包括动物消化道模拟消化器、消化液 自动输入系统、缓冲液自动输入-排空-切换系统、水解产物自动清洗系统、恒温控制系 统、信号反馈控制系统等。该系统与已有技术系统相比有几下6处创新点:①本系统通 过改变模拟消化器中缓冲液及相应消化液的组成成分,实现对单胃动物胃、小肠及大肠 的消化、吸收过程的模拟,克服了已有方法在食糜转移中出现的残留问题;②本系统通 过控制缓冲液的温度、流速间接调控模拟消化器透析管内的温度,从而可使仿生消化过 程的温度变异幅度在接近动物体温的变异范围之内(在0.4°C以内);③本系统各模拟消 化器间的缓冲液的进出口依顺序交融,可保证各模拟消化器内的化学反应条件均匀一 致,降低了测试误差;④本系统由电脑全程调控,上一消化阶段的缓冲液在清除之后、 自动输入下一消化阶段的缓冲液及自动清洗残留的产物,从而可排除由于手工操作引入 的系统误差,提高重演性;⑤本系统釆用全自动加酶,这样不仅免除了人工定时加酶带 来的不便,也使得加酶过程更加规范和精确,有利于提高实验结果的精确性与重演性。 ⑥本系统在SDS-I的基础上采用全屏单点触摸,同时进一步简化了用户界面,新界面更 加简洁生动。 在对相关研发工作的促进上,本项目幵发的猪禽饲料仿生消化法将成为饲料加工, 饲料微生物发酵、饲用酶制剂等一系列技术研发的核心工具。 8 文献综述-饲料营养价值评定方法的研究进展 vjf 1 d 丨, El 图1-1单胃动物仿生消化系统I 图1-2单胃动物仿生消化系统II Figure 1-1 Biomimetic system I Figure 1-2 Biomimetic system II 1;. — u B|丨 H、. - ^ l^^l——fi 顯KIB ,_■ SiSli 图1-3单胃动物仿生消化系统III Figure 1-3 Biomimetic system III 9 文献综述-木聚糖酶在家禽変类日粮中的应用研究进展 2木聚糖酶在家禽麦类日粮中的应用研究进展 2.1小麦饲用优势 小麦是小麦属植物的统称,是一种在世界各地广泛种植的禾本科植物,最早起源于 中东地区。小麦是世界上总产量第三的粮食作物,仅次于玉米和稻米。小麦在我国已有 5000多年的种植历史,我国的麦类作物以小麦和大麦主,约占麦类年总产量的90%以上, 其中小麦是我国主要的主要粮食产物,长江以北每年都要大面积种植。目前,我国小麦 的种植面积和总产量仅次于水稻,居我国粮食作物第二位[82]。 小麦作为饲料资源开发利用具有巨大的市场潜力和开发前景:①小麦是高产作物,种 植面积大产量高且用作饲料成本低具有价格优势;②小麦营养丰富,玉米和小麦的饲料 总能相差很小但小麦的蛋白质、赖氨酸含量高于玉米,苏氨酸含量与玉米相当;用小麦 替代玉米作为能量饲料,可降低配合饲料中的豆粕用量其营养成分与玉米、豆饼有互补 作用;小麦粗纤维含量稍高于玉米而低于豆饼;无氮浸出物略低于玉米而高于豆饼; 粗脂肪均低于玉米、豆饼;③加工方便,用途广泛,适用于各种饲料,尤其是在颗粒饲 料中使用小麦可提高饲料的黏度易于成粒[S2_84]。目前玉米价格持续上涨,加之畜牧产品 价格下跌,养殖利润下降,不少饲料企业和养殖户开始以价格较低的小麦代替玉米。开 发利用资源丰富的麦类资源,无疑具有重要意义。 2.2小麦的抗营养作用 目前,限制小麦大量应用以及引起小麦营养价值变异较大的主要原因是小麦中含有 抗营养因子,研究表明小麦中的抗营养因子是可溶性非淀粉多糖(SNSP),主要包括阿拉 伯木聚糖和P-葡聚糖,分别占小麦(干物质基础)的1.8%和0.4%[84]。Wiseman和Inborr 也报道,小麦胚乳细胞壁中含750g/kg多糖,其中85%是戊聚糖[85]。 小麦种皮中纤维素和阿拉伯木聚糖分别占其总非淀粉多糖的65%和31%,而胚乳细 胞中88%的NSP是阿拉伯木聚糖,其中NSP的结构和含量,随小麦产地、品种和生态环 境的不同而变化。非淀粉多糖含量与组成是影响营养价值的重要因素,对小麦代谢能影 响尤为显著[38,86,87]。早在1952年,Preece和Macrenzie就证实了谷物饲料中含有木聚糖 和(3-葡聚糖这两类抗营养因子,它们都是聚黏性的非淀粉多糖[88]。 所谓抗营养因子(antinutritionalfaetors,ANFs)是指植物代谢产生的,对词料中营养物 质的消化、吸收和利用产生不利影响以及使人和动物产生不良生理反应的物质,其抗营 养作用主要表现为降低饲料中蛋白质、脂肪、淀粉等营养物质的利用率、降低动物的生 11 应用单胃动物仿生消化仪评价小麦日粮添加木聚糖酶效果的可彳丁性研究 长速度和动物的健康水平等,像高粱中的单宁、豆类籽实中的凝集素、棉籽饼中的棉酚 和最常见的NSP等都归于抗营养因子的范畴[891。 小麦的主要抗营养因子即是阿拉伯木聚糖,此外还有少量的P-葡聚糖[8二%]。 2.2.1阿拉伯木聚糖的结构 Annison等提出了木聚糖的结构。由于它是由阿拉伯糖和木糖两种单糖组成的,故称 之为阿拉伯木聚糖或戊聚糖。阿拉伯木聚糖是麦类饲料中的主要的半纤维素之一,主链 是木聚糖,侧链取代基主要是阿拉伯糖,还有极少量的己糖和糖醛酸,Fincher和Stone 证明,阿拉伯糖有所也可能是被阿魏酸(femlicacid)取代[91]。各种植物体中阿拉伯木 聚糖的含量和阿拉伯残基与木糖基摩尔比的变化范围很大,主要受植物种类、品种生长 地区的生态环境等诸多因素影响[92,93]。 、一f()H , j cn-on 1 r) 'n3! ‘oil Oil OH on crukv \, 4 ii xyianasc 图2,1阿拉伯木聚糠的结构 Figure 2-1 The structure of Arabinoxylan 2.2.2理化特性 小麦中的木聚糖是非淀粉多糖的一种,所以它也具有非淀粉多糖的黏度、表面活性、 持水性等理化特性,并在溶液中影响消化过程:①粘度方面,可溶性NSP溶解后,通过 分子间相互缠绕和共价或非共价键连接成网状结构,使水溶性呈现一定的黏性。具多糖 性质的木聚糖在水中溶解后都变成有黏性的溶液,随浓度的增加,溶液黏度会大增,其 黏度与多糖的分子量、游离极性集团的数、分支程度和浓度有关。研究表明,肉用仔鸡 采食小麦阿拉伯木聚糖,增加了消化物的黏度[92]。Carder等对大麦p-葡聚糖的研究,也 得出相似的结果[94];②持水性,可溶性NSP通过分子内的羟基、酯键和醚键与水分子形 成氢键,或通过分子间相互缠绕而形成胶体携带大量的水,无论是可溶性的还是不溶性 的木聚糖都具有持水活性,一般来说,可溶性的NSP比不可溶性的NSP持水性强。不溶 12 文献综述-木聚糖酶在家禽麦类日粮中的应用研究进展 性的具有海绵一样的功能,通过由范德华力、离子力和极性作用力形成的网格状结构结 合部分水分子,而可溶性的则通过网状结构的形成而吸收水分子,这种能力称为系水力。 浓度较高时该种特性表现尤为显著,因为此时可以形成凝胶。这些效应能从根本上改变 消化物的物理特性,并改变肠道的生理活性(即增强对肠蠕动的抵抗力)[83,95];③表面 活性:多糖分子内有极性基团和非极性基团,在空间结构中形成极性区和非极性区,木 聚糖的表面带电荷,在溶液中即可以与水结合又可以和脂质界面结合,具有降低表明张 力稳定分散系的作用。小麦消化时木聚糖可与肠道中饲料颗粒、脂类、蛋白质表面相结 合;④结合能力,多糖分子通过酯键等偶联作用与饲料中的蛋白质等,如vA和VE、植 酸及多种无机离子等形成聚合物或螯合物,从而影响了它们的利用[96’97]。 2.2.3小麦阿拉伯木聚糖抗营养作用机理 NSP在动物生产在表现的抗营养作用主要有:导致动物生产性能下降,降低部分饲 料养分的消化率,饲料转化率降低,肉鸡饮水量上升,排粘性粪便或拉稀,垫草潮湿, 产蛋鸡污蛋率升高,畜舍空气和环境卫生恶化等。而小麦中阿拉伯木聚糖的抗营养作用 主要体现在以下几点:①对胃肠道食糜粘性的影响,大多数研究表明,饲料中的NSP含 量与胃肠道食糜的黏度呈正相关,但也有人认为与消化道内的可溶性大分子量碳水化合 物的关系更为密切[92,98,99]。小麦含有的木聚糖为大分子物质,持水力强,它可以吸收大 量水分或溶于水后产生黏性溶液,增加消化道内容物的黏稠度。肠道黏度增加使小肠表 面的不流动水层加厚,影响食糜与小肠表明的接触,另一方面引起营养物质在肠道内积 累,使食糜的搅动难度增加尤其是养分来的横向浓度差异增大,降低单位时间内养分的 同化作用,降低养分的消化率②对饲料表观代谢能的影响,主要是通过降低饲 料蛋白质、脂肪和淀粉的消化率起作用。小麦中的木聚糖是组成非淀粉多糖的圭要成分, 而木聚糖含量的多少直接影响到饲料中的表观代谢能(AME)。Annison等检测了非淀粉 多糖含量和表观代谢能的关系,小麦的代谢能与其中所含的戊聚糖或P-葡聚糖呈负相关 [102'103], NSP降低饲料AME的作用与动物的生长阶段还有关系,幼龄动物对NSP的应激 更为敏感、代偿能力低[95,1()4];③对脂肪和维生素D消化吸收的影响:各种NSP可能通过 不同方式影响脂肪代谢,木聚糖引起饱和长链脂肪酸吸收不良从而降低脂肪的消化吸 收,通过降低脂肪乳化效果和胆汁酸的回收率来影响脂肪消化率;另一方面,木聚糖能 相互缠绕形成胶体结构,阻止内源酶与肠道内容物接触,并伴随产生有毒、有害物质[1()5, 106];④对消化道酶活性的影响,NSP对小肠麦芽酶、海藻糖酶、蔗糖酶和乳糖酶的活性 的影响,不同试验的结果出入较大,它还影响消化道的内分泌功能,这些可以看作是动 物对SNSP的代偿行为,通过分泌大量液体降低食糜中NSP浓度,减少由黏性造成的不良 影响,酶作用于日粮中的碳水化合物.可能改变其结构,产生一些对机体具有调节作用 13 应用单胃动物仿生消化仪评价小麦日粮添加木聚糖酶效果的可行性研究 的活性物质,从而增进某些代谢激素的活性[1()7'1()9]。但这方面不同试验结果出入较大, 各试验酶活性测定时取样部位不同可能会影响结果的不一致性,还有待进一步研究;⑤ 对微生物区系的影响,有关这方面的资料还不能直接证明NSP能引起肠道微生物区系发 生改变,都是通过相关实验间接推测。肉鸡日粮中添加SNSP能显著增加小肠内的发酵, 但添加木聚糖酶即可克服此现象。研究发现用木聚糖含量高的小麦饲喂小鸡,其肠内的 微生物显著增加,因为NSP以及由于NSP影响而未能在小肠内消化的养分,是后肠微生 物的可发酵底物,所以日粮中添加NSP可促进大肠微生物的衍生。当然NSP的降解率还 有与食糜在消化道内的滞留时间等因素有关。Patel等研究发现,滞留时间长更有利于微 生物的增殖,微生物的增殖使动物消化吸收养分减少。另外SNSP对肠道微生物菌群有 影响,它通过延长消化物在小肠内滞留时间来减少消化道内的氧气,从而有助于厌氧微 生物菌群生长[82J1(M12]。 2.3木聚糖酶在家禽日粮中的应用研究进展 现代酶技术始于十九世纪70年代,首个有记载的酶是从牛胃内容物中分离出来的凝 乳酶,该酶至今仍在奶酪生产中使用。在此之后虽然一直有研究学者提出动物营养中使 用酶制剂的设想,但直到1984年芬兰在全球首次将复合酶应用于大麦基础日粮中,才正 式标志着复合酶在饲料工业的商品化,从此酶制剂就逐渐发展为生物技术领域的前卫产 业之一,也一直是国内外动物营养研究的热点[113.115]。酶制剂可消除饲料中抗营养因子, 提高了饲料原料特别是非常规原料的利用率,显示出很大缓解饲料资源短缺的潜力;另 一方面,酶制剂还能通过提高营养物质特别是氮和磷的消化率和利用率,减少畜禽氮、 磷等的排泄量,间接起到减少水体土壤等引起的环境污染,这都说明饲用酶制剂应用前 景十分广阔。尤其是2006年1月欧盟议会强制实施抗生素禁用的法令(EC NO. 1831/2003 ) 后,迫使饲料生产商不得不寻找替代品,加酶成了首选;另外,随着国际能源的供应紧 张,世界各国均把眼光投向生物能源,但玉米等饲料用粮一直紧缺,同时用于麦类饲料 的非淀粉多糖酶制剂在国内外饲料添加剂市场上方兴未艾,这对开发麦类饲料资源无疑 是一个良好的契机。木聚糖酶是小麦型日粮中非常重要的一种饲用酶制剂,它可以减轻 甚至消除小麦的一些抗营养作用,提高饲料营养价值,打破饲料资源开发利用的局限, 同时减少了动物排泄物造成的污染,对麦类饲粮的幵发利用起到十分关键的作用[116,117]。 2.3.1饲用酶制剂的种类及分类 饲用酶制剂按照不同的标准有多种分类法,但是从酶品种的组合来看,大体可分为 单酶制剂和复合酶制剂两大类:①单酶制剂,单酶制剂又可分为消化酶(内源酶)和非 消化酶(外源酶)两大类。消化酶包括淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、脂肪酶等,非消化酶 14 文献综述-木聚糖酶在家禽麦类日粮中的K、/:用研究进展 包括纤维素酶、木聚糖酶、B-葡聚糖酶、果胶酶等,另外还有植酸酶、乳糖酶、丹宁酶 等;②复合酶制剂,划分标准有很多种。依照不同的功能特点可分为为:以(3-葡聚糖酶 为主的饲用复合酶;以蛋白酶、淀粉酶为主的复合酶制剂;以纤维素酶、果胶酶为主的 复合酶制剂等;依照加入的日粮又可划分为有小麦型日粮酶制剂、大麦型日粮酶制剂和 玉米-豆粕型日粮酶制剂等。世界上己发现的酶有1700多种,生产的酶已达300多种,饲 料中应用的酶有20多种⑴8]。其中常用的一些如下表所示: 表2-1常用的饲用酶制剂 Table2-lThe General feed enzyme preparations i m ii 饲料类型 预期益处 Enzyme Function Substrate Type Benefits f 催化(3-葡聚糖酶 基于大麦、燕 家禽 减低饲料黏度 水: 生成寡糖和葡萄糖 麦、黑麦日粮 猪日粮 提高饲料利用率 、、 降解谷物淀粉 高淀粉谷物 仔猪 提高断奶幼畜曰 生成糊精和糖 日粮 犊牛日粮 粮谷物的利用率 纤维素分解酶高纤维_ !5级騎能量利用率 分子量广物和匍甸糖 饲草 催化阿拉伯木聚糖,生黑麦、小麦 猪禽日粮改善垫料质量 成小分子产物和单糖 大麦 提高饲料利用率 降解寡糖和其他 大豆及其他 猪日粮 提高能量利用率 a ‘ 抗营养因子 豆科植物 降低下痢发病率 植酸酶 提高磷的利用率 多种日粮 猪禽日粮减少无机磷需要 催化蛋白质生成肽 小麦副产品 大豆或蛋提高蛋白质消化 蛋白酶 工甘^ , , 率、减少氮的排 和氨基酸 显科蛋白 白代乳料… 出 动物性和 宠物日粮提高脂肪消化率 脂肪酶 催化脂肪生成脂肪酸 ^ I 植物性脂肪 肉仔鸡日粮加强能量储备 备注:制表参考Odgen,1995; Rotter, 1989; Cowan, 1992等[119_12】]。 2.3.2木聚糖酶的分类、理化特性及分子结构特点 狭义的木聚搪酶仅限于内切-P-1,4-木聚糖酶,广义的木聚糖酶是指能够降解半纤 维素木聚糖的一组酶的总称,主要包括三类:如下表2-2。 15 应用单胃动物仿生消化仪评价小麦日粮添加木聚糖酶效果的对行性研究 表2-2木聚糖酶的分类 TabIe2-2 Classification of the Xylanase iS CAS编号 作用端 水解产物 Name CAS Number Sites of action Hydrolyzate 内切-(3-1,4- 木聚糖和 主耍为木二糖与木二糖 木聚糖酶 EC3.2.1.8 长链木寡糖 以上的寡聚木糖也有少 量的木糖和阿拉伯糖 外切-P-1, 4- 木聚糖和木寡 木聚糖酶 EC3.2.1.9 糖的非还原端 木糖 1,4-p-D-木聚糖 丄二… EC3.2.1.37 木寡糖末端 木糖残基 木糖水解酶 不同来源木聚糖酶的组成和性质不尽相同,但它们在理化性质方面仍存在较大的相 似性,如下表2-3: 表2-3木聚糖酶的理化性质 Table 2-3 The Physical and Chemical Properties of the Xylanase 理化性质 分子量 等电点 最适温度 Molecular Isoelectric The optimum Properties pH value weight point temperature 3-10彳11围内fe定, 最适温度一般在 范围 大多数酶反应的 4060°C之间,在 Range 8-145KD 310 最适范围是47 60°C时酶活性保 在2.512范围内 持在80%以后随 能保持85%的酶活 温度升高而下降 2.3.3木聚糖酶在家禽业上的应用 2.3.3.1木聚糖酶对肉鸡生长性能的影响 上世纪五十年代Jensen和McGinnis首次报道在大麦日粮中添加粗酶制剂可以提高肉 鸡的生产性能。高峰等、彭玉麟研究进一步证实,家禽麦类日粮添加木聚糖酶可提高日 增重与饲料转化率[122_124]。于旭华报道日粮中添加真菌性木聚糖酶和细菌性木聚糖酶后, 4-9周龄的黄羽肉鸡饲料转化率均显著提高CP<0.05)[125]。王金全通过实验也证实添加木 聚糖酶的小麦日粮能够明显改善肉鸡的生产性能,平均日增重较不加酶提高9.12% (P<0.05),饲料转化效率提高10.87%,死淘率降低达60%(P<0.05)[126]。 2.3.3.2木聚糖酶对肉鸡表观代谢能和养分消化率的影响 16 文献综述-木聚糖酶在家禽麦类R粮中的)、V:用研究进展 NSP对饲料表观代谢能(AME)的影响,主要是通过降低饲料蛋白质、脂肪和淀粉 的消化率起作用。近年来,国内外有关酶制剂在肉仔鸡小麦日粮中的作用效果报道很多。 小麦日粮中添加木聚糖酶可明显提高小麦日粮的AME[127]。Annison等研究表明添加酶制 剂后的小麦日粮的AME可提高6.8710.73 %[128]。彭玉麟等也研究证实小麦日粮添加木聚 糖酶提高AME2.14%[124]。王金全等报道添加木聚糖酶可提高小麦日粮的AME,且木聚 糖酶添加剂量与AME呈正相关关系[126]。Choct等报道,木聚糖酶对能值低的小麦作用较 大,而对能值高的小麦作用较小。RaVindran#[129^S道添加酶可提高小麦型日粮 AME2.8%。综上可见,木聚糖酶无疑能改善肉仔鸡小麦日粮的能量利用效率,但就改 善程度很难有一个确定的比例关系。这主要是因为NSP与代谢能的关系受NSP种类、饲 料类型、试验动物的生理阶段等因素的影响,且SNSP对饲料能值的影响大于其对养分 的稀释作用,这一现象近年来受到研究者的重视。 在麦类日粮中添加木聚糖酶可提高日增重和饲料转化率,主要原因是提高了养分消 化率Bird研究发现肉仔鸡小麦日粮中添加具有内切木聚糖酶活性的酶制剂对其 生产性能和养分利用率均有正效应,但改善程度差异较大[82』3]。大量的研究成果显示 SNSP降低饲料淀粉和脂肪回肠消化率的作用非常明显,但对蛋白质消化率的影响结果 不一。Almirall等和Marquardt等研究发现添加酶制剂能显著改善了营养物质的回肠消化 率[134,135]。Mollah等也很好的建立了淀粉消化率和AME的相关性,研究证实明谷物饲料 中添加聚糖酶后可提高淀粉消化率_&128,131]。另外彭玉麟[124]报道发现木聚糖酶能消除 戊聚糖的抗营养作用,从而提高了日粮淀粉、脂肪消化率和肉仔鸡的生产性能。各种NSP 可能通过不同方式影响脂肪代谢,木聚糖引起饱和长链脂肪酸吸收不良从而降低脂肪的 消化吸收,通过降低脂肪乳化效果和胆汁酸的回收率来影响脂肪消化率。另一方面,木 聚糖能相互缠绕形成胶体结构,阻止内源酶与肠道内容物接触,并伴随产生有毒、有害 物质,木聚糖在降低脂肪消化吸收率的同时,也降低脂溶性维生素的吸收[1()5,1()6]。研究 证实麦类日粮中添加木聚糖可以提高其脂肪消化吸收率[82,m,136]。Hew等研究报道小麦 日粮中加入两种阿拉伯木聚糖酶后,日粮中各氨基酸在粪中的消化率显著提高,将日粮 氨基酸回肠末消化率由平均0.78分别提高至0.84和0.85[137]。除常量养分外,NSP也影响 微量影响成分的吸收利用,但由于NSP的来源和结构的多样性,对饲料矿物质利用的影 响较为复杂,就现有资源很难得出一致的结果。 2.3.3.3木聚糖酶对家禽消化器官发育及血液理化指标的影响 NSP对家畜消化道发育的影响较为复杂,一定量的日粮纤维有利于幼畜消化道生长 且有清泄作用,但含量过高会给动物带了一系列不良影响。Johnson等认为动物消化道对 17 应用单胃动物仿生消化仪评价小麦口粮添加木聚糖酶效果的njl丁性研究 日粮纤维水平变化的适应速度相当快[138]。NSP影响消化道的相对重量,研究报道大麦円 粮加酶后降低消化道的相对重量,饲喂麦类R粮的家禽,其消化道器官(肌胃、腺胃、 小肠)较饲喂玉米基础日粮重量增加,体积增大,胴体百分率降低[139,14()]。彭玉麟研究 结果显示添加木聚糖酶的肉鸡小麦日粮能降低腺胃肌胃相对重量(18.9729.31%)和肌 胃相对重量(5.639.38%)。但也有报道加酶小麦日粮不影响消化道重量,发而胰脏相 对重量有所降低(达16%)。NSP还影响消化道组织相对生长,高峰研究发现肉仔鸡小 麦曰粮中添加复合酶制剂(主要是p-葡聚糖酶和木聚糖酶),可显著提高肉仔鸡胴体重, 胸肉重、腿肉重和脂肪重[123,141]。 有报道表明NSP还可影响消化道的分泌功能,但这方面的资料主要从人的营养研究 试验中得到,Khokhar对此进行了综述[142]。我国学者韩正康于2000年提出SNSP会抑制 与生长和代谢有关的内分泌机能[143],研究发现日粮中添加NSP酶可明显改善动物的消化 代谢和体外周血液代谢激素的水平和增强家禽的免疫机能。高宁国和韩正康[144]研究显 示大麦日粮中添加0.1%复合酶,肉仔鸡血液生长激素(GH),三碘甲腺原氨酸、四碘甲 腺原氨酸(T3,T4)及胰岛素(Ins)水平均有提高,但胰高血糖素水平降低。王利等报道 小麦基础饲粮中添加木聚糖酶显著提高了生长猪血清葡萄糖、三碘甲腺原氨酸、四碘甲 腺原氨酸(P<0.05)和极显著提高D-木糖含量(P<0.01),极显著降低血清尿素氮含量 (P<0.01)。高峰等在60%小麦日粮加0.15%酶制剂后,实验发现血液中三碘甲腺原氨酸、 四碘甲腺原氨酸(T3,T4),胰岛素、IFG-I水平均有所提高[141]。这些可以看作是动物对 SNSP的代偿行为,通过分泌大量液体降低食糜中NSP浓度,减少由黏性造成的不良影响, 酶作用于日粮中的碳水化合物可能改变其结构,产生一些对机体具有调节作用的活性物 质,从而增进某些代谢激素的活性。 2.3.3.4木聚糖酶对内源消化酶活性的影响 NSP对小肠麦芽酶、海藻糖酶、蔗糖酶和乳糖酶的活性的影响,不同试验的结果出 入较大,且针对日粮中不可消化的NSP与动物体内消化酶活性之间的报道较少,早期的 研究是以日粮纤维的形式报道的。Schneeman和Gallaher年研究发现,可溶性日粮纤维提 高了大鼠肠道内蔗糖酶、麦芽糖酶的活性和淀粉酶的总量。刘强进行NSP提取物与淀粉 酶活性关系的体外研究时发现基本可以肯定脱去无机离子对小麦非淀粉多糖提取物对 淀粉酶活性具有抑制作用。但是Adamson等通过在大鼠日粮中分别添加SNSP和INSP, 19天后加SNSP组的麦芽糖酶和海藻糖酶活性降低而蔗糖酶和乳糖酶活性不变,INSP组 四种酶活性均显著提高,外源酶通过营养体内NSP含量来发挥对内源酶活性的影响但程 度不一[145,146]。外源酶对内源酶的影响十分复杂,有多种因素对其结果产生影响,已有 18 文献综述-木聚糖酶在家禽麦类日粮中的应用研究进展 的相关报道中有的表现两者协同,有的为抑制,甚至有研究显示无效果。从大多数结果 来看,木聚糖酶提高内源消化酶活性的变异较大,分析各试验酶活性测定时取样的部位 不同,这可能是影响结果不一致的因素之一,但无确凿报道还有待于进一步研究。 图2-2加酶前后植物细胞壁变化情况 Figure 2-3 The change of plant cell wall before or after the enzyme preparations added 3研究目的与意义 3.1目的与意义 前期动物营养学国家重点实验室在单胃动物仿生消化系统的研究上取得了重大进 展,业己开发出SDS-III型仿生消化系统,并研制了基于试剂酶的模拟鸭消化液试剂盒。 在逼近鸭体内消化过程的基础上,大大提高了饲料样品消化率测定值的重演性。这为 进一步检验仿生法酶解能值与生物学法代谢能值间的相关关系提供了必要条件。 为了进一步考察基于SDS-III仿生消化系统定量测定饲料养分生物学效价方法标 准化的可行性,本试验参照仿生法操作标程测定了玉米豆粕等标准样品在本实验室条 件下的干物质消化率,并结合北京动物营养重点实验室仿生消化课题组的相关数据, 通过对比两实验室间的测试差异,探讨该系统在不同实验室间测定干物质消化率的重 演性和精度。为确立基于仿生消化系统定量测定饲料养分生物学效价方法标准化提供 参考,也为饲料代谢能值酶学评定方法的应用提供参考依据。 19 应用单胃动物仿生消化仪评价小麦日粮添加木聚糖酶效果的町行性研究 近年来,随着畜牧业的发展,饲料工业对饲料营养价值评定方法的的精度和效率要 求也愈来愈高,而随着离体法的不断发展,也逐渐成熟为一种实用简捷的估测饲料生物 效价性的方法。同时在酶制剂效果评定方面,相对于传统动物试验的耗时费力、易受实 验动物等各种不可控因素影响,离体法越发体现出它在饲用酶制剂作用效果快速评价的 优势。由于离体法是对体内消化环境实现模拟再现,故它也可一定程度上对体内试验起 到指导参考作用。但由于动物体内真实的消化代谢生理过程十分复杂,受到胃肠道微生 物区系、消化酶互相作以及动物自身生长阶段等诸多因素的影响,体外试验评定的酶作 用效果是否科学合理、多大程度上能重现于动物实验,尚需体内试验给予验证。只有在 精密控制的和高度可重演的动物试验条件下才能摸索出某一特定酶制剂,针对特定的饲 料,在特定的动物特定生理阶段下的表观能量值与营养浓度之间存在的某种关系。现阶 段,酶制剂的生产应用技术尚不完善,关于外源酶在动物日粮中作用效果结果不一。添 加多少酶量能产生多大经济效益,我们希望看到酶制剂添加对饲粮营养价值提高的较具 体数据,理想状态是计算机自动测量控制酶的添加量,从而最大限度地发挥酶在动物营 养中的作用效果。基于单胃仿生消化系统已取得的研究成果,本实验旨在利用SDS体外 快速评定的功能评价加木聚糖酶日粮的体外消化率与酶添加量的关系,为木聚糖酶在小 麦类型日粮中的应用效果提供参考,将为酶制剂的高效应用提供一种新思路。 20 % 铽 — fi J [=^> I r—| m H- s 区 ElK TXL g T, 雖 a jiw ^ U 写 ￥ ^ '三 N7 1Va 5: 深 ￡= -oz ^r> t ^ ^ I 1——r n m 当藥 銶 t 鉍 urv 5 W E_^ i k片 ^ ■en m 蘇 /n | rn mrnrn 0 r-1 I I | L 一I t! 1 °i \H —— 51 磐紘姻 ——V ) Y 雜 沒造洱 联 迄 W 辍 —— % 旺 L-ZJ 4H 燊 rg \ 滎 “Q “ 劫 _ ^廷 ^运 蕤 ^ __ + =^> f n ~— ⑴ ^ — u 栽 迴 > W | ^ 躲声运 tej 彼 > fr 妮 S ^ 制 盤 丰 ± 农 Si w ^ ^; 造 哲摆鸷 拄 35 # T T 丁丁 ^r 抝 1 T 丁下 1 (N (^) 应用单胃动物仿生消化仪评价小麦n粮添加木聚糖酶效果的B丨行性研究