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氟橡胶246B作为胆管替代物的可行性研究报告DOC

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英文摘要 致谢 导师及作者简介1 英文缩略词 ePTFE expanded polytetrafluoroethylene 膨体聚四氟乙烯 BMC autologous bone marrow cells 自体骨髓细胞 MVEC microvascullare endothelial cell 微血管内皮细胞 BMSC bone marrow-derived mesenchymal stem cell 骨髓间充质干细胞 FPM fluoroelastomer 氟橡胶 PP polypropylene 聚丙烯 IARC International Agency for Research on Cancer 国际癌症研究机构 WHO World Health Organization 国际卫生组织 Td thermal decomposition temperature 热分解温度 Tg glass transition temperature 玻璃化转变温度2 前 言 胆道疾病是普外科的常见病、多发病,胆道手术也一直是外 科手术的难点,胆道系统疾病往往需要切除或切开胆管、并进行 各种方式的胆肠吻合,使胆管、Oddi 括约肌功能丧失甚至结构缺 如,手术难度大,而且由于胆管组织损伤后再生能力低下,处理 棘手 [1] ,术后容易发生胆漏、胆管狭窄、反复胆道逆行感染乃至胆 汁性肝硬化等并发症。彭承宏教授认为提高胆道吻合质量是解决 问题的关键 [2] ,但由于生理结构的改变,并发症的出现仍然难以避 免。 胆道并发症的出现常常需要进行二次手术甚至多次手术,这 不仅增加了患者的经济负担,还会严重影响其生活质量。人们一 直在追求设计一种可以代替胆道及Oddi括约肌结构和功能的人工 胆管,来解决胆道修复与重建的难题。与人工血管、人工补片、 人工关节、人工骨和人工心脏瓣膜等技术相比,人工胆管研究明 显滞后。胆道返流与胆管狭窄仍然是人工胆管临床应用研究中亟 待解决的重点问题。近年来,材料学、生物化学、干细胞、组织 工程学以及纳米技术的发展和制造工业水平的提高,大大的推动 了人工胆管的研究进程。 作为人体内植入物,人工胆管材料必须具备如下性质,1、组 织液不能改变其理化性能;2、化学上是惰性;3、不引起炎症及 异物反应;4、无致癌性;5、能够对抗机械性应力;6、能够消毒3 使用;7、不引起变态或过敏反应;8、可根据需要制作成不同形 状。但现阶段,完全符合上述全部要求的材料并不存在,我们只 能寻找和发现更多的材料加以对比、选择。 本研究中,我们采用氟橡胶 246B 作为研究对象。氟橡胶 246B 对热、强酸、强碱、强氧化剂和溶剂等具有优异的稳定性,中等 粘度,并具有加工性好的特点。我们先对氟橡胶 246B 作为人工胆 管替代物的可行性进行初步评估。 1、化学惰性 氟橡胶 246B 的一系列化学惰性都是氟原子给予的。首先,氟 元素是已知化学元素中负电性最强的元素,氧化程度最高,其聚 合物不易被氧化分解;其次,氟原子半径为 0.64 A,几乎是 C-C 键原子间距的一半,因此氟原子能紧密的排列在碳原子的周围, 形成了对 C-C 键的屏障,保证了 C-C 键的化学惰性,不易受侵蚀; 最后,F-C 键的键能极高,并且由于氟原子的存在使 C-C 键能增 加,从而提高了氟有机物的化学稳定性。由于这些分子结构上的 特点,使氟橡胶分子处于非常稳定的状态,不受热和活泼化学物 的侵袭,这就是氟原子赋予氟橡胶很高的热稳定性、化学稳定性 和抗氧化性的原因 [33] 。 2、致癌性 WHO 所属的国际癌症研究机构(IARC)对 900 种化学物、 混合物和接触场所对人的致癌性进行综合评价,并将结果分为 4 组 [34,35,36] ,4 Ⅰ组为人类致癌物(Carcinogenic to humans),具有充足人群致 癌资料者列入该类。此外,一些化学物、混合物尽管人类的致癌 性资料尚不是很充足,但是实验动物致癌性资料充足,并且有充 足的资料显示该化学物、混合物作用于接触人群的致癌机制是与 动物致癌机制相类似的,也可列入该类。共 95 种。 Ⅱ组 A 为很可能是人类致癌物(Probably carcinogenic to humans),有部分人类致癌性的流行病学证据,但实验动物致癌性 证据充足的一类化合物列入该类。在某些情况下,如流行病学证 据不足,但实验动物致癌性证据充分,且确切的证据显示使动物 致癌的机制在人类中也起作用,也应列入该类。共 66 种。 Ⅱ组 B 为可能是人类致癌物(Possibly carcinogenic to humans),包括人类致癌性的流行病证据不足,但动物实验致癌性 证据充分的一类化合物、混合物。有时,虽然流行病学资料不充 分,动物致癌性资料也有限,但有其它相关资料支持,也列入该 类。共 241 种。 Ⅲ 组 为 未 分 类 的 人 类 致 癌 物 ( Not classifiable as to carcinogencity to humans),人类致癌性的流行病学证据不确切,且 实验动物致癌证据也不确切或有限的化学物、混合物、环境接触 物归入此类。此外,流行病学致癌性证据不充分,但实验动物致 癌性证据充足,而且有足够的实验证据表明实验动物致癌机制也 作用于人类的一类化学物(混合物)也归入此类。不能放入其它任何 类别的化学物也放在此类。共 497 种。5 Ⅳ组为很可能不是人类的致癌物,流行病学和实验动物中缺 乏致癌性数据的一类化学物、混合物归入此类。有时,流行病学 致癌证据不确切,并且动物实验明确证实无致癌性的一类化合物 也归入之中。共 1 种。 IARC 的致癌性综合评价中并没有对氟橡胶 246B 的直接评 价,我们只能从它的分子结构中进行分析。氟橡胶 246B 是偏氟乙 烯、四氟乙烯、六氟丙稀的三元共聚体,偏氟乙烯、四氟乙烯与 咖啡、汽油类似,同属于Ⅱ组,六氟丙稀属于Ⅲ组。由此我们推 断,氟橡胶的致癌性应介于Ⅱ组、Ⅲ组之间,但具体、准确的致 癌性评价还有待于进一步的临床观察及分析。 3、根据需要制作不同形状 氟橡胶 246B 是一类线型柔性高分子聚合物,分子链间次价力 小、柔性大,因而具有加工性能良好的自身特点,在外力作用下 还可产生较大形变,除去外力后能够迅速恢复原状。其独特的结 构、易改性和易加工的特点,使其具有其他材料不可比拟、不可 取代的优异性能,从而广泛用于科学技术、国防建设和医疗卫生 等国民经济各个领域,并已成为现代社会生活中衣食住行用各个 方面不可缺少的材料。6 综 述 胆道手术一直是外科手术的难点,胆道系统疾病往往需要切 除或切开胆管、并进行各种方式的胆肠吻合,使胆管、Oddi 括约 肌功能丧失甚至结构缺如,手术难度大,而且由于胆管组织损伤 后再生能力低下,处理棘手 [1] ,术后容易发生胆漏、胆管狭窄、反 复胆道逆行感染乃至胆汁性肝硬化等并发症。彭承宏教授认为提 高胆道吻合质量是解决问题的关键 [2] ,但由于生理结构的根本性改 变,并发症的出现仍然难以完全避免。 发生胆漏时可出现腹痛、腹肌紧胀、反跳痛等腹膜炎症状和 体征、腹腔引流管内引出胆汁样液体;轻度胆道狭窄可无明显的 症状和体征,中重度胆道狭窄可出现进行性严重肝功能损害和胆 管炎症状,当伴有肝动脉血栓形成时尤为明显。若患者出现 ALT、 胆红素、碱性磷酸酶和 γ-谷氨酰转移酶等升高,尤其当后三者升 高程度与 ALT 升高程度不成比例,且无其他疾病诊断证据时,提 示可能有胆道并发症。术后胆道并发症的诊断主要依据临床表现、 实验室检查及 B 超、磁共振胆胰管检查或逆行胆胰管造影检查 [3] 。 胆道并发症的出现常常需要进行二次手术甚至多次手术,这 不仅增加了患者的经济负担,并会严重影响其生活质量。人们一 直在追求设计一种可以代替胆道及Oddi括约肌结构和功能的人工 胆管,来解决胆道修复与重建的难题。与人工血管、人工补片、 人工关节、人工骨和人工心脏瓣膜等技术相比,人工胆管研究明7 显滞后。胆道返流与胆管狭窄依旧是人工胆管临床应用研究中亟 待解决的重点问题。近年来,材料学、生物化学、干细胞、组织 工程学以及纳米技术的发展和制造工业水平的提高,推动了人工 胆管的研究进程。 1 胆管替代物的研究背景 早在 1952 年,Voorhees 等人 [4] 使用维纶材料(Vinyon “N”) 研制成功了人工血管,成为人工管道历史上具有重要意义的里程 碑。同年,Mccorriston 等人发明了人工胆管。1962 年,Sterling 等人 [5] 成功的将人工胆管作为先天性胆道闭锁患儿术后肝外胆道 重建的替代物,获得了 4-9 年的术后存活率。这也是最早的有关 人工胆管成功应用于临床的报道。随着材料学的发展以及制造水 平的提高,Hughes 等人 [6] 于 1964 年用聚四氟乙烯制作了人工胆管 并用于胆道梗阻时的胆道重建。此后尽管也研制了很多种不同材 料的人工胆管,但仅仅作为胆道的替代物,无法根本解决胆道反 流与胆管狭窄的问题,虽然有些人工胆管经过了动物及临床试验, 但仍没有可商品化的人工胆管问世。 2 胆管替代物的分类及临床应用 广义的胆管替代物包括自体或人工的胆管替代物或移植物。 2.1 自体胆管替代物主要包括以下几种, 2.1.1 阑尾间置胆管重建术,早在 10 年前,同济医院的魏明 发教授已尝试采用此种术式 [7] ,此后仍有部分学者试用,要求术中 阑尾无病变、系膜及动脉血供至肝门处无张力即可。但阑尾周围8 淋巴组织丰富,而且管腔较狭窄,一旦发生炎症易导致胆汁排出 不畅 [8] 。 2.1.2 回盲部间置胆管重建术,尚有部分学者采取此种术式, 游离回盲部后两端切断,向上翻转置于胆总管与十二指肠之间。 据报道,术后防止胆汁返流效果较好,但由于此手术破坏正常生 理结构,易造成肠道消化功能障碍,且回盲部淋巴组织丰富,术 后如发生炎症反应仍难以避免肿胀而形成再次梗阻。 2.1.3 胆囊间置肝管十二指肠吻合术 [9] ,术后胆囊主要起通道 作用,原胆汁引流至胆囊不潴留,直接进入肠道,使胆汁各成分 稀释,因此,胆囊结石的发生机会明显减少。 2.1.4 自体静脉移植,蔡景修 [10] 应用带蒂脐静脉瓣修复胆管缺 损取得较好效果。其他改良的术式还有经胆囊颈管胆汁转流术, 带血管蒂胆囊袢或胃壁袢修复肝外胆管非周径缺损等。Scudamore 等人 [11] 还报道了应用人类羊膜在猪体内进行胆道重建的方法。但 各种术式均为部分学者所试用,均难以完全达到胆道重建的要求, 尤其是不能避免返流性胆管炎的发生,因此,尚不能广泛的应用 于临床。 2.2 胆管的移植物, 胆管移植物主要包括异体移植、异种移植以及胆管干细胞移 植,但这几种人工胆管方式均处于理论研究阶段,并没有真正的 应用于试验及临床医疗工作,也没有相关的文献报道。 异体移植作为一种先进的医疗方式已经在临床工作中广泛开9 展,如肾脏移植、肝脏移植、心脏移植等,但术后对于排斥反应 的预防和治疗仍有很多问题需要解决,而且对于胆管的移植仍然 无法完全解决术后狭窄梗阻和 Oddi 括约肌功能恢复的问题。 异种移植是指将动物器官(组织、细胞)或体外接触过动物 器官(组织、细胞)的人体体液、细胞、组织,移植或输注人体 的一种治疗方法。近年来,由于人类器官短缺,异种移植已经成 为当今器官移植学的新领域,但仍存在超急性排斥反应、急性血 管性排斥反应和细胞介导的排斥反应以及异种移植受者的病毒感 染等诸多问题。 干细胞具有较强的增殖、自我更新及多方向分化的能力。现 阶段,我们已经通过人类胚胎干细胞的定向分化得到了平滑肌细 胞、心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞系、造血细胞系等 [12,13] 。除 了造血干细胞、骨髓间质干细胞和骨髓干细胞等成体干细胞移植 成功外,近来对神经干细胞、骨骼肌干细胞、肝干细胞、表皮干 细胞和肠道干细胞的研究也很多。目前较公认的肝干细胞来源有 肝卵圆细胞、胎肝前体细胞、小肝细胞及骨髓肝干细胞和胰腺上 皮细胞,其中后两种是非肝源性肝干细胞 [14,15] 。肝干细胞在肝脏 的形成和再生中有重要作用,可以分化为肝细胞、胆管上皮细胞 和胰腺上皮细胞等。随着对其特性的深入了解,它将代替肝细胞 移植和肝脏器官移植成为治疗器官衰竭的一种重要细胞来源,在 体外对肝干细胞进行分离纯化和培养扩增,将对肝的细胞移植、 组织工程和基因治疗等起到重要作用 [16] 。干细胞技术要在移植领10 域广泛开展,首先需要解决的是如何实现未分化干细胞在体外的 大量增殖,然后通过干细胞的诱导分化得到各种祖细胞直至各种 体细胞。 2.3 胆管的人工替代物 几十年来,随着组织工程学和材料学的迅速发展,以及各国 学者的不懈努力,越来越多的人工材料诞生并应用于临床。人工 胆管作为人体内的永久植入物,应具备良好的生物相容性和机械 性能,后者主要表现为,(1)有较高的缝接强度;(2)具有一 定的弹性,其变形能力应和所替代的器官或组织相近;(3)具有 长期的稳定性,无明显的生物降解现象;(4)表面具有一定的粗 糙度以利于周围细胞的附着和生长;(5)易于制造加工;(6) 具有一定的抗腐蚀性。用于制作人工胆管的材料很多,包括尼龙、 真丝、奥纶、聚氨酯、涤纶、聚四氟乙烯等。目前应用最多的是 涤纶和膨体聚四氟乙烯。 涤纶最初应用于人工血管,早在 1957 年即已研制成功。目前 在临床大口径血管移植中有较为可靠的效果,远期通畅率较为肯 定。但对于内径小于 6mm 的小口径血管,由于血管内高张力、低 血流的状态,6 个月栓塞率高达 40% [17] 。涤纶所构成的网状结构 网孔较大,移植后易出现渗血,因此,应用前需要进行预凝,待 纤维蛋白填充网孔后再行移植。新型的涤纶材料出厂前已用凝胶、 蛋白等进行表面处理,应用前无需预凝,大大方便了临床应用。 膨体聚四氟乙烯(ePTFE)由氟和碳元素组成,惰性无毒,具有11 极稳定的理化性质和持久不变的张力。作为人工材料应用于临床 始于 1970 年,由 William Gore 研制成功,最初用于人工血管。它 不可生物降解,生物相容性好,植入体内不产生炎性吸收反应, 可作为长久的结构支架;其体积的 80%为纤维间隙或无物空间, 此网状结构容许细胞游走及组织向内长入材料中。人工血管在管 状的膨体聚四氟乙烯外也包绕一层由膨体聚四氟乙烯所制的加固 薄膜,坚韧而柔软,具备一定的强度和张力,而且可由常规高压 蒸汽或环氧乙烷熏蒸消毒。特别是膨体聚四氟乙烯人工血管作为 成熟产品已在临床使用多年,其质量和特性稳定,可避免自行制 备材料带来的不稳定因素。缺点是该材料为疏水性,不利于细胞 的粘附和生长,但经过一定处理的膨体聚四氟乙烯可使细胞附着 于其表面 [18] 。与涤纶相比,它的网孔较小,数量更多,质地柔软, 内面光滑,无需预凝即可用于临床,且不易形成血栓。现膨体聚 四氟乙烯已广泛应用于临床,同时也成为优良的人工胆管的制作 材料。 纳米技术的发展,可以为组织工程提供具有纳米级微结构的 生物材料,可以更好的调节与其相接触细胞的粘附、铺展与基因 表达过程 [19,20] 。但纳米高分子材料的合成方法和在体内的降解速 度,以及机械强度和可塑性等还需进一步研究。 人工胆管移植后如果可以避免以下两种并发症,即可认为效 果良好 [21] ,1、胆道重建后的阻塞性黄疸;2、胆汁泄漏所致胆汁 性腹膜炎。近来,许多学者通过种植 BMCs(自体骨髓细胞)的12 方法成功制成人工血管 [22] 和人工小肠 [23] ,并指出 BMCs 在促进血 管上皮细胞形成方面具有确切作用。Mitsuo Miyazawa [19] 等人将 BMCs 种植在人工胆管的管状结构内层,希望以此加速胆管上皮 细胞生长,防止胆汁泄漏,但实验结果显示,胆管上皮细胞的生 长速度在种植 BMCs 组和非种植 BMCs 组无明显差别。还有学者 在胆管替代物中移植小肠黏膜下层作为补片或插入移植物 [24] ,这 两种形式中,虽然没有支架结构,但在移植后的两周内,小肠黏 膜下层都形成了胆管的上皮结构。但有许多报告指出,小肠黏膜 下层在用于移植过程中组织再生时会出现收缩 [25] 。可见,组织工 程人工器官替代物的研究方面还存在诸多争议,需要我们的进一 步实验来证实。理想的组织工程胆管应该具有融合的内皮层和分 化静止的平滑肌细胞层,以及足够的动力学整合性和弹性,便于 缝合固定,能够承受胆道收缩和膨胀的压力 [26] 。 2.4 胆管的上皮细胞与平滑肌细胞 肝外胆管分粘膜、肌层和外膜三层。粘膜有纵行皱襞,上皮为 单层柱状,有杯状细胞,固有层内有粘液腺。肝管和总胆管的上 1/3 段肌层很薄,平滑肌分散;总胆管的中 1/3 段肌层渐厚,尤其 是纵行平滑肌增多;总胆管下 1/3 段的肌层分内环行、外纵行两层。 胆管外膜为较厚的结缔组织。胆管纵行平滑肌收缩可使管道缩短, 管腔扩大,有利于胆汁通过。 理想的组织工程人工胆管需具有类似的结构和功能,尤其要具 有类似的上皮细胞和平滑肌细胞。但现阶段对于人工胆管上皮细13 胞或平滑肌细胞的报道仍很少。 Meerbaum 等以 ePTFE 为支架材料,接种自体皮下脂肪来源的 MVEC(自体微血管内皮细胞)后回植入体内作外周血管重建, 实验结果,3 年通畅率仅为 19%,与未种植 MVEC 的研究结果接 近 [27] 。MVEC 省略了体外培养扩增过程,但不足之处在于收获得 到 MVEC 混杂了大量的非内皮细胞,不纯的内皮细胞回植后导致 内膜增生继而影响长期通畅率。已经实施的纯化方案是利用 MVEC 的特异表面标记,利用免疫磁珠法将其分离,包括 UEA-1、 CD31、CD34 等 [28] 。但还有待进一步实验研究确定。 骨髓来源的间充质干细胞(BMSC)是一种具有多向分化潜能 的干细胞,理论上可以分化为所有间充质细胞。已有研究证实, BMSC 在体外具有分化为血管平滑肌细胞的能力 [29] 。Seung 等将分 离纯化的狗骨髓干细胞体外诱导培养 2 周,至第 2 代后细胞已分 化为平滑肌样细胞,将此细胞接种于管形 PLGA 材料,继续培养 后回植裸鼠皮下,4 周后组织学检测证实有新组织形成,并且表达 平滑肌特异性标记,荧光标记证实新生组织主要由植入细胞构成 [30] 。日本东京女子医科大学报道了 42 例以自体骨髓细胞接种材料 后即刻回植,治疗先天性心血管疾病的研究,除 1 例因左心发育 不全综合征死亡外,其他病人术后平均 584 天内保持通畅,无血 管瘤和血栓形成 [31] 。 3 胆管替代物的发展前景 由于人体胆管结构和功能的复杂性,符合正常生理功能的胆14 道重建也对胆管替代物提出了更高的要求,Oddi 括约肌再造以及 抗胆汁返流成为人工胆管难以回避的问题。许建衡等 [32] 以耐受胆 汁的医用级聚醚型聚氨酯热塑性弹性体 TPE-80B 为原料设计了膈 下气囊连接双层套囊式胆管假体作为胆总管置换物,通过假体内 层的节律性挤压作用达到排空胆汁的目的。实验证明,这一设计 使胆管内胆汁主动排空,胆管内压超过十二指肠内压, 因此,内 容物不易返流进入胆管,而且胆汁也不易滞留在胆道内造成沉淀 和梗阻。但目前这项研究只进行了初步的动物试验,尚有待更深 入细致的研究观察。 随着组织工程技术的发展,在功能上与 Oddi 括约肌相似的组 织工程心脏瓣膜的研究已取得初步进展。而具有仿生阀门的人工 胆管,由于具有 Oddi 括约肌“压力控制,定向开放”的仿生特点, 也必将成为未来人工胆管的发展趋势。 总之,胆管替代物的临床应用是现代胆道外科不可或缺的组 成部分,它的出现与广泛应用,也必将推动胆道外科的迅猛发展。 对胆道外科的深入研发是肝胆外科最重要的发展方向之一。15 材料与方法 一、研究对象, 氟橡胶246B为白色或淡黄色弹性体,分子式 -[-(-CH 2 -CF 2 -)x-(-CF 2 -CF 2 -)y-(CF(CF 3 )-CF 2 -)z-]n-,为偏氟乙烯、四 氟乙烯、六氟丙稀的三元共聚体,共聚比x,y,z=65,20,15, 比重1.84,玻璃化转变温度-13℃-18℃,热分解温度390℃-410℃, 使用温度范围-30℃-288℃,能在250℃长期使用,对热、强酸、强 碱、强氧化剂和溶剂等具有优异的稳定性,中等粘度,加工性好。 二、方法, 1. 氟橡胶 246B 薄片胆汁浸泡实验 1.1 材料、设备 直径 13cm、厚度 0.5mm 氟橡胶 246B 薄片 8 片,50ml 烧杯 8 个,恒温箱 1 台,NETZSCH STA449C 型差热-热重仪 1 台, NETZSCH DSC204 型差热分析仪 1 台,日本 AGS-H 5KN 拉力实 验机 1 台(吉林大学超分子结构与材料教育部重点实验室提供),新 鲜胆汁若干(取自吉林大学第一医院普外科胆囊切除、胆总管探 查取石、T 管引流术后,无发热、无黄疸、术中无肿瘤发现患者)。 1.2 方法 氟橡胶薄片的制作,取氟橡胶 246B 材料 18g,切为均匀小块 后置于直径 15cm 平底玻璃皿内,再倒入溶剂四氢呋喃 20ml,24 小时后氟橡胶充分溶解、溶剂四氢呋喃挥发约 10ml,继续使四氢16 呋喃于常温下自然挥发,24 小时后四氢呋喃挥发完毕,形成氟橡 胶薄片,直径 13cm,厚度 0.5mm。 取 8 例胆囊切除、胆总管探查取石、T 管引流术后,无发热、 无黄疸、术中无肿瘤发现患者新鲜胆汁,分别置于 8 个相同清洁 烧杯内,量约 50ml;于每张直径 13cm、厚度 0.5mm 氟橡胶 246B 薄片内各裁下 50mm×10mm×0.5mm 矩形薄片 2 片,其中 1 片放入 盛有新鲜胆汁的烧杯内浸泡,并放入 37℃恒温箱内保存,隔天更 换新鲜胆汁,另外 1 片分别测量拉伸强度、热分解温度、玻璃化 转变温度。 1.3 观察指标 薄片浸泡 30 天后取出,测量其自身拉伸强度、热分解温度、 玻璃化转变温度,与浸泡前测得值进行对比,以明确其作为胆管 替代物长期处于胆汁环境内是否改变其理化性质。 2. 氟橡胶 246B 薄片消毒实验 2.1 材料、设备 直径 13cm、厚度 0.5mm 氟橡胶 246B 薄片 8 片,普通电热锅 1 个,甲醛蒸气熏蒸消毒柜 1 个(吉林大学第一医院手术室提供), NETZSCH STA449C 型差热-热重仪 1 台,NETZSCH DSC204 型 差热分析仪 1 台,日本 AGS-H 5KN 拉力实验机 1 台(吉林大学超 分子结构与材料教育部重点实验室提供),10%甲醛溶液 500ml。 2.2 方法 氟橡胶薄片的制作,同氟橡胶 246B 薄片胆汁浸泡实验。17 于每张直径 13cm、厚度 0.5mm 氟橡胶 246B 薄片内各裁下 50mm×10mm×0.5mm 矩形薄片 4 片,其中 1 片放入普通电热锅内 加水煮沸至 100℃,持续 1 小时;1 片放入甲醛蒸气熏蒸消毒柜内 熏蒸 24 小时;1 片放入 10%甲醛溶液中浸泡 30 分钟;1 片分别测 量拉伸强度、热分解温度、玻璃化转变温度。 2.3 观察指标 氟橡胶 246B 薄片经煮沸法、甲醛蒸气熏蒸法、甲醛溶液浸泡 法消毒后取出,测量拉伸强度、热分解温度、玻璃化转变温度, 与消毒前测得值进行对比,以明确其作为人体内植入物经消毒处 理后是否改变其理化性质。 3. 氟橡胶 246B 薄片大鼠体内植入实验 3.1 材料 3.1.1 动物选择,普通雄性大鼠,4-5 周龄,体重 150±10g(吉 林大学基础医学部实验动物中心提供),清洁级条件饲养。 3.1.2 手术器械及设备,小动物外科手术器械一套,包括持针 器、手术刀、剪刀、纹式钳;手术无影灯;小动物手术台(自制); 4 号丝线,乙醚, 5ml 注射器针头,纱布,棉球;以及 15mm×15mm×0.5mm 的氟橡胶 246B、膨体聚四氟乙烯、聚丙烯、 聚乙烯薄片。 3.2 方法 氟橡胶薄片的制作,同氟橡胶 246B 薄片胆汁浸泡实验。 将大小、厚度相等的氟橡胶 246B、膨体聚四氟乙烯、聚丙烯、18 聚乙烯薄片分别植入 8 只大鼠腹腔内;要求大鼠体重相近。 3.2.1 动物准备 术前禁食 5h,不禁水。腹部正中备皮,清洁手术;均采用乙 醚开放吸入麻醉;双人裸视操作。 3.2.2 薄片植入手术 乙醚开放吸入麻醉成功后,取仰卧位,四肢固定于手术台上, 术野强力碘消毒,上腹部纵行切口进腹,切口长约 3cm。将薄片 充分消毒后,剪除锐角,以丝线缝合固定于侧腹膜,检查无腹腔 及切口出血,无肠管扭曲,视为手术成功。然后分腹肌和皮肤两 层用 4 号丝线连续缝合关腹,手术完毕。 3.2.3 术后处理 术后将大鼠在暖气下保温,温度保持在 26℃左右;不用抗生 素及免疫抑制剂;禁食 1h。清洁饲养,每天饲养室行紫外线消毒 一次,每天更换鼠笼内垫料,防止排泄物导致感染。 3.3 观察 3.3.1 方法 大鼠术后生存30天后开腹取薄片周围组织置于10%甲醛溶液 中固定,常规石蜡包埋,切片 6um,苏木精-伊红染色(HE 染色)。 3.3.2 指标 观察病理片中变态反应细胞、炎症细胞数量,判断腹腔内炎 症、异物反应情况,以及是否引起变态或过敏反应。19 结 果 1、胆汁浸泡后理化性能变化 热分解温度(thermal decomposition temperature) 1 2 3 4 5 6 7 8 浸泡前 401.2 401.5 400.4 401.1 402.0 401.5 401.8 400.4 浸泡后 402.4 400.7 401.5 401.0 403.0 399.5 400.4 402.1 浸泡后组与浸泡 前 组 相 比 P=0.862,P>0.05 玻璃化转变温度(glass transition temperature) 1 2 3 4 5 6 7 8 浸泡前 -4.5 -3.1 -4.2 -4.7 -4.8 -2.1 -3.0 -3.6 浸泡后 -3.9 -4.0 -4.4 -4.1 -5.1 -4.1 -5.2 -3.4 浸泡后组与浸泡 前 组 相 比 P=0.216,P>0.05 热分解温度 397 398 399 400 401 402 403 404 1 2 3 4 5 6 7 8 度温 浸泡前 浸泡后 玻璃化转变温度 -6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 度温 浸泡前 浸泡后20 拉伸强度(tensile strengh) 1 2 3 4 5 6 7 8 浸泡前 102.4 103.1 103.8 104.0 104.1 104.7 103.8 102.2 浸泡后 103.1 104.2 102.8 103.4 104.2 105.7 102.6 102.4 浸泡后组与浸泡 前 组 相 比 P=0.908,P>0.05 2、消毒处理后理化性能变化 热分解温度(thermal decomposition temperature) 1 2 3 4 5 6 7 8 消毒前 400.6 399.2 400.8 401.0 403.1 401.7 400.8 400.6 煮沸 399.5 400.1 401.0 401.6 402.8 399.1 400.6 402.2 甲醛蒸气 400.2 399.0 401.7 400.7 403.5 400.0 401.4 400.5 甲醛浸泡 399.8 400.5 399.1 402.2 403.4 401.7 401.1 399.1 煮沸法与消毒前 相 比 P=0.839 , P>0.05;甲醛蒸气 法与消毒前相比 P=0.873,P>0.05; 甲醛浸泡法与消 毒 前 相 比 P=0.869,P>0.05 拉伸强度 100 101 102 103 104 105 106 1 2 3 4 5 6 7 8 力拉 浸泡前 浸泡后 热分解温度 398 399 400 401 402 403 404 1 2 3 4 5 6 7 8 度温 消毒前 煮沸 甲醛 甲醛浸泡21 玻璃化转变温度(glass transition temperature) 1 2 3 4 5 6 7 8 消毒前 -3.2 -5.4 -4.1 -3.2 -4.2 -2.0 -3.7 -4.1 煮沸 -3.1 -4.5 -4.4 -2.4 -6.1 -3.2 -2.7 -3.1 甲醛蒸气 -2.0 -5.2 -3.7 -3.1 -5.8 -1.9 -3.2 -3.1 甲醛浸泡 -3.2 -5.2 -5.8 -2.1 -4.1 -2.6 -4.2 -3.4 煮沸法与消毒前 相 比 P=0.930 , P>0.05;甲醛蒸气 法与消毒前相比 P=0.699,P>0.05; 甲醛浸泡法与消 毒 前 相 比 P=0.932,P>0.05 拉伸强度(tensile strengh) 1 2 3 4 5 6 7 8 消毒前 102.5 102.0 103.5 103.6 101.7 103.3 104.4 102.2 煮沸 103.1 101.2 102.8 102.4 103.4 101.0 105.4 102.2 甲醛蒸气 102.5 101.4 103.1 103.2 102.7 103.5 105.5 101.1 甲醛浸泡 102.8 101.2 102.5 103.6 102.1 104.4 100.6 403.3 煮沸法与消毒前 相 比 P=0.770 , P>0.05;甲醛蒸气 法与消毒前相比 P=0.983,P>0.05; 甲醛浸泡法与消 毒 前 相 比 P=0.593,P>0.05 玻璃化转变温度 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 度温 消毒前 煮沸 甲醛 甲醛浸泡 拉伸强度 100 101 102 103 104 105 106 1 2 3 4 5 6 7 8 顿牛 消毒前 煮沸 甲醛 甲醛浸泡22 3、大鼠体内材料植入后的变态、过敏反应及炎症、异物反应 在本实验中,大鼠在薄片植入后一般状态良好,至 30 天薄片 取出时无 1 例死亡,术后观察无 1 例出现烦躁不安、耸毛、抓鼻、 喷嚏、尿便失禁、呼吸困难等表现;取出薄片后取周围组织制作 病理标本观察,无明显嗜酸性粒细胞及其他变态反应细胞浸润。 根据一般病理诊断标准,我们把中性粒细胞、巨噬细胞、淋 巴细胞计作炎症细胞,作为衡量炎症程度的指标,将 400 倍视野 平均分为 16 份,取每张病理切片中炎症细胞最多部分进行记数, 对比聚乙烯、聚丙烯、ePTFE、FPM-246B(见图 5、6、7、8), 可得如下结果, 1 2 3 4 5 6 7 8 聚乙烯 12 10 8 11 10 13 12 12 聚丙烯 9 6 10 8 8 7 6 9 ePTFE 8 7 9 5 6 6 8 5 FPM-246B 6 8 9 5 4 5 4 6 FPM-246B 与聚乙 烯相比 P<0.01;与 聚 丙 烯 相 比 P=0.03,P<0.05; 与 ePTFE 相 比 P=0.308,P>0.05 炎症程度 0 5 10 15 1 2 3 4 5 6 7 8 症细胞记数炎 聚乙烯 聚丙烯 ePTFE FPM-246B23 讨 论 胆道疾病是普外科常见病、多发病,胆道手术也一直是外科 手术的难点,胆道系统疾病往往需要切除或切开胆管、并进行各 种方式的胆肠吻合,使胆管、Oddi 括约肌功能丧失甚至结构缺如, 手术难度大,而且由于胆管组织损伤后再生能力低下,处理棘手 [1] 。 人们一直在追求设计一种可以代替胆道及Oddi括约肌结构和功能 的人工胆管,来解决胆道修复与重建的难题。近年来,材料学、 生物化学、干细胞、组织工程学以及纳米技术的发展以及制造工 业水平的提高,推动了人工胆管的研究进程。 作为人体内植入物,人工胆管材料必须具备如下性质,1、组 织液不能改变其理化性能;2、化学上是惰性;3、不引起炎症及 异物反应;4、无致癌性;5、能够对抗机械性应力;6、能够消毒 使用;7、不引起变态或过敏反应;8、可根据需要制作成不同形 状。 本研究中,我们采用氟橡胶 246B 作为研究对象,并对氟橡胶 246B 作为人体内植入物、人工胆管材料的特性进行初步评估。评 估结果,氟橡胶 246B 基本符合 1.化学上是惰性、2.无明确致癌性、 3.可根据需要制作成不同形状的特点。 我们通过对氟橡胶 246B 进行新鲜胆汁浸泡、常规方式消毒和 大鼠体内植入的测试,进一步明确氟橡胶 246B 成为人体内植入24 物、人工胆管替代物的可能性。 1、胆汁对其理化性能影响 根据使用范围不同,用来衡量高分子材料理化性能变化的指 标很多。在本实验中,氟橡胶 246B 作为人工胆管材料、人体内植 入物,需要长期浸泡于胆汁碱性环境、对抗胆管内压力,并且保 持良好的抗老化性、弹性和承受机械应力的能力,因而,我们选 择热分解温度、玻璃化转变温度、拉伸强度三个主要方面对氟橡 胶 246B 进行理化性能变化测试。 1.1 热分解温度(thermal decomposition temperature,Td),高 聚物开始发生受热分解时的温度。它是选择高聚物成型加工温度 的重要依据,也是热稳定性和抗老化性的重要标志。因加工方式 区别,氟橡胶 246B 的热分解温度在 390℃-410℃之间。实验中我 们采用 NETZSCH STA449C 型差热-热重仪测量所选取的氟橡胶 246B 材料热分解温度为 400.4℃-402.0℃,经过胆汁浸泡 30 天后 热分解温度为 399.5℃-403.0℃,最大变化值 2.0℃,统计学计算 P>0.05,两者无显著差异。我们认为 30 天胆汁浸泡对于氟橡胶 246B 热分解温度无明显改变,材料热稳定性和抗老化性保持良好。 1.2 玻璃化转变温度(glass transition temperature,Tg),对于 非晶聚物,对它施加恒定的力,观察它发生的形变与温度的关系, 通常称为温度形变曲线或热机械曲线。非晶聚物有三种力学状态, 它们是玻璃态、高弹态和粘流态。在温度较低时,材料为刚性固 体状,与玻璃相似,在外力作用下只会发生非常小的形变,此状25 态即为玻璃态,当温度继续升高到一定范围后,材料的形变明显 增加,并在随后的一定温度区间内形变相对稳定,此状态即为高 弹态,温度继续升高形变量又逐渐增大,材料逐渐变成粘性的流 体,此时形变不可能恢复,此状态即为粘流态。我们通常把玻璃 态与高弹态之间的转变,称为玻璃化转变,它所对应的转变温度 即是玻璃化转变温度,或是玻璃化温度。因加工方式区别,氟橡 胶 246B 的玻璃化转变温度在-13℃-18℃之间。实验中我们采用 NETZSCH DSC 204 型差热分析仪测量所选取的氟橡胶 246B 材料 玻璃化转变温度为-4.8℃--2.1℃,经过胆汁浸泡 30 天后测得玻璃 化转变温度为-5.1℃--3.4℃,最大变化值 2.2℃,统计学计算 P>0.05, 两者无显著差异。因此我们认为 30 天胆汁浸泡对于氟橡胶 246B 的玻璃化转变温度也无明显改变,材料高弹性状态保持良好。 1.3 拉伸强度(tensile strengh),材料在拉伸过程中最大可以 承受的应力。作为人体植入物,必须能够对抗一定的机械性应力, 因此拉伸强度是衡量氟橡胶 246B 是否可以作为人工胆管替代物 的重要指标。实验采用日本 AGS-H 5KN 拉力实验机,浸泡前承受 最大拉力 102.2N-104.7N,胆汁浸泡 30 天后最大拉伸强度测得 102.4N-105.7N,最大变化值 1.2N,统计学计算 P>0.05,两者无显 著差异。可见,材料所能承受最大拉伸强度无明显改变,材料在 浸泡后仍然可以对抗较大的机械应力。 2、对抗机械应力能力 胆道内的正常压强为 0.49-0.98kPa,而肝脏分泌胆汁的正常压26 强为 2.94-3.43kPa [37] ,当胆道内压力大于肝脏的正常分泌压力后胆 汁停止分泌,胆道内压力也不再增加,因而可以计算胆管壁所承 受的最大压力在 14.77056-17.23232N 之间,所得数值远小于氟橡 胶 246B 薄片在胆汁浸泡前、浸泡后所能够承受的拉伸强度。因此 我们认为氟橡胶 246B 有足够的对抗机械应力能力。 3、消毒使用 消毒是指杀灭病原微生物和其他有害微生物,并不要求清除 或杀灭所有微生物(如芽孢等)。灭菌是指杀灭一切活的微生物, 要求高于消毒。现在常用的灭菌方法包括高温、紫外线、电离辐 射和某些药液的蒸气等,医院内以高温最为普遍。 在实验中对氟橡胶246B进行煮沸法(温度100℃,维持60分钟, 此法尤其适用于橡胶类物品)、甲醛蒸气熏蒸法(浓度40%,维持 24小时)和甲醛溶液浸泡法(浓度10%,维持30分钟)消毒处理, 然后测量其拉伸强度、热分解温度、玻璃化转变温度各方面变化。 消毒处理前,氟橡胶246B热分解温度在399.2℃-403.1℃之间, 玻璃化转变温度在-5.4℃--2.0℃之间,拉伸强度在101.7N-104.4N 之间;煮沸法消毒后,氟橡胶246B的热分解温度在399.1℃-402.8℃ 之间,玻璃化转变温度在-6.1℃--2.4℃之间,拉伸强度在 101.0N-105.4N之间,三项指标煮沸法消毒前后两两比较均无显著 差异(P>0.05);甲醛蒸气熏蒸法消毒后,氟橡胶246B的热分解温 度在399.0℃-403.5℃之间,玻璃化转变温度在-5.8℃--1.9℃之间, 拉伸强度在101.1N-105.5N之间,三项指标甲醛蒸气熏蒸法消毒前27 后两两比较均无显著差异(P>0.05);甲醛溶液浸泡法消毒后,氟 橡胶246B的热分解温度在399.1℃-403.4℃之间,玻璃化转变温度 在-5.8℃--2.1℃之间,拉伸强度在100.6N-104.4N之间,三项指标 甲醛溶液浸泡法消毒前后两两比较均无显著差异(P>0.05)。 氟橡胶246B的热分解温度高达390℃-410℃,使用温度范围 -30℃-288℃,能够在250℃长期使用,对热、强酸、强碱、强氧化 剂和溶剂等具有优异的稳定性。因此我们认为氟橡胶246B完全可 以进行消毒使用。 4、变态及过敏反应 变态反应即抗原与抗体或致敏淋巴细胞反应,在排除抗原的 同时,造成了机体的免疫损伤,是一类异常的病理性免疫应答。 变态反应是由血清中 IgE 介导的,IgE 可通过血清被动转移使人及 动物发生过敏反应。此反应发生较快,一般在几秒至几十分钟内 发生,称为早期反应,早期反应消失快,不留组织损伤;也有个 别在接触变应原后 4-6 小时发生,称为晚期反应,主要以嗜酸性 粒细胞浸润为主。大鼠一般为良好的变态反应动物模型,变态反 应多在 1-3 分钟后发生,动物表现烦躁不安、耸毛、抓鼻、喷嚏、 尿便失禁、呼吸困难,多因支气管平滑肌痉挛而窒息死亡。在本 实验中,大鼠在薄片植入后一般状况良好,至 30 天薄片取出时无 1 例死亡,术后观察无 1 例出现烦躁不安、耸毛、抓鼻、喷嚏、尿 便失禁、呼吸困难等上述表现;取出薄片后取周围组织制作病理 标本观察,无嗜酸性粒细胞浸润。因而,我们认为氟橡胶 246B 在28 大鼠动物模型中并未出现明显变态或过敏反应,但在人体内是否 会发生变态或过敏反应仍有待于进一步的临床实验及观察。 5、炎症及异物反应 炎症是指具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御 反应,依据病程经过可分为急性炎症和慢性炎症两大类。急性炎 症起病急骤,持续时间短,仅几天到一个月,以渗出病变为其特 征,炎症细胞浸润以中性粒细胞为主;慢性炎症持续时间较长, 常数月到数年,常以增生病变为主,炎症细胞浸润以巨噬细胞和 淋巴细胞为主。 异物或病原体在活体内不能被消化,刺激长期存在,常造成 慢性炎症,并在炎症局部形成主要由巨噬细胞增生构成的境界清 楚的结节状病灶,称为慢性肉芽肿炎症(chronic granulomatous inflammation)。慢性肉芽肿结节较小,直径一般为 0.5-2mm。 在本实验中,取四种材料周围组织制作病理切片观察,均未 见慢性肉芽肿炎症结节,氟橡胶 246B 材料周围炎症细胞浸润最为 轻微,每个 400 倍视野均分 16 份后,可见最多炎症细胞 4-9 个, 与膨体聚四氟乙烯材料相当,统计学计算 P=0.308,P>0.05,两者 无明显差异;聚乙烯材料周围炎症细胞浸润最重,每个 400 倍视 野均分 16 份可见炎症细胞 8-13 个,与氟橡胶 246B 相比 P<0.01, 两者差别显著;聚丙烯材料介于氟橡胶 246B、膨体聚四氟乙烯和 聚乙烯之间。因而我们认为,氟橡胶 246B 与膨体聚四氟乙烯同样 具有引起周围组织炎症轻微的特点,是良好的人体内植入物材料。29 结 论 1、氟橡胶 246B 的热分解温度、玻璃化转变温度、拉伸强度 主要理化性质在胆汁浸泡 30 天后未发生明显改变。 2、氟橡胶246B能够较好的对抗机械性应力。 3、氟橡胶246B能够消毒使用。 4、氟橡胶 246B 在大鼠体内未出现明显变态或过敏反应,但 在人体内是否会发生变态或过敏反应有待于进一步的临床实验及 观察。 5、氟橡胶 246B 在大鼠体内引起炎症反应轻微,但在人体内 炎症反应情况有待于进一步的临床实验及观察。30 附 图 图 1,手术器械及设备 图 2,腹腔暴露方式 图 3,ePTFE 薄片植入 图 4,FPM-246B 与组织粘连轻微 图 5,聚乙烯周围组织 ×400 图 6,聚丙烯周围组织 ×400 图 7,FPM-246B 周围组织 ×400 图 8,ePTFE 周围组织 ×40031